黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶的重组表达及应用
基于乙酰胆碱酯酶(AChE)受抑制原理的有机磷与氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法在我国应用范围广泛。作为国家技术标准与农业行业标准，快速检测法在我国农药残留检测工作发挥了一定的作用。但是目前我国用于农药检测的乙酰胆碱酯酶商品普遍存在敏感性低与稳定性差等不足，影响了农药残留检测结果的可信度，并很大程度上限制了快速检测技术的发展。采用高活性、稳定性强的乙酰胆碱酯酶对于农药残留检测十分重要。本文利用巴斯德毕赤酵母成功表达了黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶(DmAChE)，并尝试了基于该酶的农药残留快速检测产品的研制。首先，我们以黑腹果蝇RNA为模板，用反转录扩增技术获得编码乙酰胆碱酯酶的cDNA。切除其5'端的信号肽编码序列和位于3'端的糖磷脂(GPI)锚定序列，与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接，利用电击转化使该cDNA整合至毕赤酵母基因组。通过酵母重组子的快速筛选方法，在固体培养基上筛选到7个高效表达DmAChE重组酶(R-DmAChE)的酵母菌株。以摇瓶培养条件下，这些重组酵母菌株将R-DmAChE分泌至培养液，活性可达400U/mL。通过硫酸铵分部沉淀法初步纯化重组酶，在40-80％饱和度的硫酸铵溶液中R-DmAChE的得率为93％。稳定性测试结果表明R-DmAChE在4℃可长期保存于中性磷酸盐缓冲液中，22天后保留75％的活性。R-DmAChE具有与天然DmAChE相似的酶动力学参数，底物过量抑制常数为50.9±2.8mM。它对敌敌畏、氧化乐果、甲基对氧磷、西维因、克百威与抗蚜威等我国常用有机磷与氨基甲酸酯类农药的双分子速率常数依次为4.4E6，2.2E4，4.2E5，5.9E5，5.1E6，2.3E5/M/min，均高于电鳗、线虫与人源的AChE。R-DmAChE对敌敌畏、涕灭威和西维因等农药的敏感度比天然酶增强了3-9倍。与国内检测领域常用酶相比，该酶受10种有机磷与氨基甲酸酯类农药的半抑制浓度更低。在添加农药标准品的蔬菜样品中，0.01mg/kg的敌敌畏或克百威可使R-DmAChE80％的活性受抑制。使R-DmAChE活性损失达50％以上的随机抽取的蔬菜产品，经色谱检测均残留有不同的有机磷或氨基甲酸酯类农药。上述研究表明，R-DmAChE是有机磷与氨基甲酸酯类农药快速检测的理想生物材料。
黑腹果蝇;乙酰胆碱酯酶;巴斯德毕赤酵母;有机磷;氨基甲酸酯;农药残留检测
上海海洋大学;上海水产大学
硕士
海洋生物学
张大兵;周志刚
2006
中文
Q969.462.2
58
2006-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）