条浒苔Rubisco聚集蛋白核影响因子研究及rbcL基因序列分析
本文主要用条浒苔(Enteromorphaclathrata)为材料，应用胶体金标免疫电镜分子定位技术，研究了外界因子对光合作用第一个关键酶核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose1,5-Bisphosphatecarboxylase/oxygenase，E.C.4.1.1.39，简称Rubisco)在蛋白核和叶绿体基质之间迁移的影响，进而研究蛋白核在藻类CCM机制中重要作用。同时首次克隆了条浒苔Rubisco全长基因(rbcL)和rbcL5’上游非翻译区序列，为进一步研究Rubisco聚集蛋白核的分子机制奠定基础。
首先应用生化分离纯化技术，对条浒苔Rubisco进行了分离提取和纯化，以制备Rubisco抗体，用于Rubisco金标免疫电镜分子定位研究。通过硫酸铵分步沉淀、TSKDEAE650离子交换柱层析分离纯化了条浒苔的Rubisco，并免疫注射兔子制备了Rubisco抗体。纯化样品经过SDS-PAGE，Native-PAGE电泳和Western免疫印迹检测鉴定，条浒苔Rubisco大小亚基分子量分别约为50kD和16kD，全酶的分子量在500kD左右。
以生长迅速、细胞具多个蛋白核的大型海藻条浒苔作为材料研究光照因素和CO2浓度对条浒苔Rubisco在蛋白核和叶绿体基质之间迁移的影响。应用金标免疫电镜分子定位技术对Rubisco集中蛋白核程度进行数值化分析。电镜下可观察到标记Rubisco的金颗粒大部分集中分布在蛋白核中。根据Morita[1]提出的方法，设定PR-ratio值(蛋白核内分布的Rubisco总量与蛋白核外类囊体基质中的Rubisco总量之比)作为衡量Rubisco集中蛋白核程度的分析指标。结果发现，在光强变化长期影响实验中，当藻体转入较高光强时，Rubisco明显由叶绿体基质向蛋白核中聚集，从而更好地完成其光合作用功能。在完全黑暗处理和光合作用阻断剂DCMU处理短期影响中，并未观察到PR-ratio的明显降低，但PR-ratio在24小时中的波动被提前，这可能是由正常生物节律的破坏和藻类对不良环境的反应机制造成。此外，结果显示条浒苔对光强变化的微小变化并不敏感。不同CO2浓度对于Rubisco分布的长期影响和短期影响研究均显示CO2浓度升高时，Rubisco倾向于向叶绿体基质中扩散；CO2浓度较低或无CO2培养时，Rubisco不断向蛋白核中集中。研究结果显示，当光强较强或CO2浓度较低，藻类Rubisco可能通过集中蛋白核以活化来固定有限的CO2，保证光合作用正常进行。蛋白核可能在光合作用和CCM机制中具有重要作用。
通过PCR特异性扩增叶绿体基因编码的条浒苔大亚基编码序列rbcL部分基因序列(1035bp)。依据基因步移原理，首次克隆得到条浒苔rbcL5’上游非翻译区序列(224bp)。此外，依据3'-RACE(cDNA末端快速扩增技术)原理，克隆得到条浒苔rbcL3，末端cDNA序列(537bp)。根据3段序列，Rubisco大亚基全长基因序列和氨基酸序列可被推测得到。据推测，rbcL5’上游非翻译区序列存在类似原核生物的启动子元件-10区(AATAAT)和-35区(TTGATA)。其他信息有待进一步研究分析。该研究为藻类CCM机制的分子生物学研究奠定r基础。
条浒苔;蛋白核;核酮糖1,5-二磷酸羧化酶;加氧酶;启动子;基因序列
上海海洋大学;上海水产大学
硕士
海洋生物学
何培民
2006
中文
S968.413
70
2006-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）