RNAi抑制前列腺癌细胞PC-3中survivin基因表达的实验研究
本研究首先运用免疫细胞化学，免疫印迹技术及RT-PCR技术详尽的检测了5个前列腺癌细胞系中survivin在蛋白水平及mRNA水平上的表达，结果显示，各前列腺癌细胞系survivin阳性细胞百分率，PC-3为23.4％，DU145为18.7％，LNCaP为15.2％，22RV1、PC-3M分别为11.5％和12.8％。免疫细胞化学染色阳性分值，PC-3为49.42±4.71，PC-3M为28.45±6.82，DU145为34.27±6.08，LNCaP为34.09±5.22，22RV1为31.66±7.13。以PC-3细胞系中survivin的表达量最高(P＜0.01)。Westernblot结果显示，PC-3、LNCaP、DU145细胞系中的survivin蛋白总量相对较高，而22RV1、PC-3M中的survivin蛋白总量相对较低，RT-PCR结果显示，五种前列腺癌细胞系中均有survivin的表达，但以PC-3、LNCaP中的survivinmRNA水平较高。研究结果表明，在研究survivin与前列腺癌的发生机制、抗药性机制及作为新前列腺癌药物靶位的可行性研究工作中，前列腺癌细胞系PC-3、LNCAP和DU145细胞可为首选。
随后采用siRNA表达载体pSilencerTM3.1-H1neo构建针了对survivin基因的siRNA表达载体，首先根据siRNA设计原则及survivin的cDNA序列选取并设计survivin基因特异性插入序列共3对6条，将合成的DNA正义链及反义链经变性、退火，形成双链DNA后再用T4DNA连接酶与pSilencerTM3.1-H1neo线性质粒连接，重组质粒经酶切及DNA测序鉴定后，用脂质体法转染非雄激素依赖前列腺癌细胞系PC-3，通过RNA干涉阻断PC-3细胞中survivin基因的表达，用RT-PCR，免疫印迹技术和免疫细胞化学染色检测survivin的表达变化，并用流式细胞技术、MTT法检测survivin基因表达沉默后对PC-3细胞的抗凋亡能力，分化增殖能力，对化疗药物的敏感性等方面的变化。DNA序列测定结果证实设计合成的DNA正确插入了载体。RT-PCR、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验表明，除pSilencer3.1-SVV1重组载体不能有效地阻断了PC-3细胞中survivin基因的表达以外，pSilencer3.1-SVV2和pSilencer3.1-SVV3重组载体均有效地阻断了PC-3细胞中survivin基因的表达。与对照组相比，survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P＜0.01)，并且转染PC-3细胞后，细胞的凋亡增加了10-15％，细胞生长速度明显变慢，其细胞数在84h时与对照组相比减少约30％，G1期细胞增加了10％，G2期和S期细胞减少了5％以上。在顺铂的作用下，pSilencer3.1-SVV2、pSilencer3.1-SVV3重组质粒转染的PC-3细胞的细胞凋亡增加了10％至14％，存活数则下降了约35％至45％。
为了进一步观察RNAi介导的survivin基因沉默对PC-3前列腺癌细胞在裸鼠体内的瘤体形成能力的影响，应用构建的pSilencer3.1-SVV1、pSilencer3.1-SVV2、pSilencer3.1-SVV3质粒和阴性对照质粒pSilencer3.1-NC转染PC-3细胞后，将PC-3细胞接种于荷瘤裸鼠皮下，观察转染了各质粒的PC-3细胞在裸鼠体内成瘤能力的变化。结果显示，pSilencer3.1-SVV2和pSilencer3.1-SVV3质粒转染组的裸鼠肿瘤成瘤率明显下降，裸鼠瘤体生长速度明显慢于未转染组和pSilencer3.1-NC质粒转染组(P＜0.01)。实验终止时，肿瘤平均体积与瘤重与未转染组和pSilencer3.1-NC质粒转染组相比减少50％～55％。研究结果表明，RNAi介导的survivin基因沉默可明显影响PC-3细胞裸鼠体内成瘤能力及瘤体生长速度。
本研究初步阐明了survivin基因沉默对前列腺癌细胞的分化增殖，抗凋亡，体内瘤体形成及对化疗药物的敏感性等方面所产生一系列影响，证明了survivin基因在这些方面所发挥的重要作用，为进一步研究survivin基因与前列腺癌的关系以及以survivin基因为靶点的前列腺癌基因治疗奠定了基础。
前列腺肿瘤;凋亡抑制基因;基因表达;核糖核酸干涉
第四军医大学
硕士
临床检验诊断学
郝晓柯
2006
中文
R737.25;R730.59
83
2006-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）