siRNA沉默PC3细胞中KDR基因表达的实验研究
本研究首先采用免疫细胞化学，免疫印迹技术及RT-PCR技术检测了5个前列腺癌细胞系中VEGF和KDR在蛋白水平及mRNA水平上的表达，采用ELISA检测前列腺癌细胞培养上清VEGF含量。各前列腺癌细胞系VEGF及KDR的免疫细胞化学染色阳性分值，PC-3为56.42±3.25、45.65±3.23，PC-3M为38.45±4.51、29.82±4.65，DU145为50.52±5.32、39.27±4.32，LNCaP为53.09±3.89、43.78±3.22，22RV1为40.66±6.31、32.66±5.13，在PC-3、DU-145和LNCaP中表达较高(P＜0.01)。Western-Blotting结果显示，PC-3、LNCaP、DU145细胞系中的VEGF及KDR蛋白总量相对较高，而22RV1、PC-3M相对较低。RT-PCR结果显示，五种前列腺癌细胞系中均有VEGF及KDR的表达，但以PC-3、LNCaP、DU145中的VEGF及KDR水平较高。五种前列腺癌细胞系培养上清VEGF含量ELISA结果，PC-3为498±32pg/ml、DU-145为510±32pg/ml、LNCaP为560±45pg/ml，而22RV1和PC-3M分别为265±30pg/ml和320±29pg/ml，在后两者中表达较低(P＜0.01)。研究结果表明，虽然VEGF及其受体KDR在前列腺癌细胞中的表达量不近相同，但二者的表达对研究前列腺癌的发生发展及其机理有十分重要意义，前列腺癌细胞系PC-3、LNCAP和DU145细胞可作为前列腺癌KDR靶基因治疗的首选。
根据GenBank数据库提供的KDR基因核苷酸序列，按照Tuschl设计原则，设计双链小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)，合成能表达其小发卡结构RNA(SmallhairpinRNAs，shRNA)的DNA序列，并与pSilencer3.1-H1neo质粒定向连接，构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的siRNA表达载体pSilencer3.1-KDR1，pSilencer3.1-KDR2，pSilencer3.1-KDR3，经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。
构建的pSilencer3.1-KDRsiRNA表达载体和PSilencer3.1-NC，脂质体Lipofectamine2000瞬时转染PC-3细胞；pEGFPN2质粒同步转染PC-3细胞，荧光倒置显微镜下观察转染效率。RT-PCR检测KDRmRNA水平，免疫细胞化学染色和Western-Blotting检测KDR蛋白质表达的变化，MTT检测细胞增殖，流式细胞仪(FCM)检测细胞周期。
转染后24小时，经荧光倒置显微镜观察细胞转染效率约为65％。转染后72小时，RT-PCR结果显示，pSilencer3.1-KDR3载体能有效的抑制了PC-3细胞中KDR基因mRNA的表达；免疫细胞化学染色和Western-Blotting检测结果表明pSilencer3.1-KDR3载体能有效的抑制KDR蛋白的表达；细胞生长曲线显示pSilencer3.1-KDR3转染的PC-3细胞的生长速度明显减慢；细胞周期检测结果表明，pSilencer3.1-KDR3可将更多的细胞阻滞在G0～G1期，阻止细胞进入S期，从而抑制细胞增殖，而其余抑制效果不明显。
在体外实验的基础上，将瞬时转染各组siRNA表达载体pSilencer3.1-KDR和PSilencer3.1-NC以及未转染的PC-3细胞接种于裸鼠的右后肢皮下，观察肿瘤的生长情况及其微血管密度。结果表明，与pSilencer3.1-KDR1、pSilencer3.1-KDR2、PSilencer3.1-NC和未转染组相比，pSilencer3.1-KDR3组肿瘤的生长受到明显抑制，平均体积较小(0.28cm3VS0.74cm3，0.715cm3，0.721cm3，0.795cm3P＜0.01)，平均瘤重较轻(0.14gVS0.657g，0.611g，0.615g，0.609g)，且肿瘤血管密度减低(2.1±1.1VS5.2±1.3，5.4±1.3，5.3±1.2，5.9±1.5P＜0.05)。
实验结果表明，pSilencer3.1-KDR重组载体有效的抑制了KDR分子的表达，从而影响PC-3细胞的生长以及肿瘤血管的生成，为进一步研究抗肿瘤血管的生成治疗奠定了基础。
肿瘤细胞;血管内皮生长因子;细胞分裂增殖;基因表达抑制
第四军医大学
硕士
临床检验诊断学
郝晓柯
2006
中文
R730.2;R329.28
81
2006-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）