重组hepcidin的分离纯化及鉴定
Hepcidin是一个主要在肝脏表达的含8个半胱氨酸残基的小分子多肽，是机体铁稳态调控途径中关键性的效应分子，其主要生物学功能在于调节小肠上皮细胞对于铁的吸收。另外，hepcidin和许多富含半胱氨酸的抗菌肽类似具有显著的抗菌作用。本文采用基因工程菌表达的His-hepcidin融合蛋白包涵体，通过IMAC、氧化、复性及酶切，得到了具有生物活性的hepcidin重组蛋白，并验证了重组蛋白的抗菌活性。
在8mol/L尿素的变性条件下对融合蛋白进行金属螯合层析。融合蛋白采用咪唑与降低pH相结合的两步洗脱方式进行纯化，首先以60mmol/L低浓度咪唑洗脱杂蛋白，然后pH4.0洗脱融合蛋白。经两步洗脱纯化后的融合蛋白纯度大于95％。金属螯合层析中融合蛋白收率不低于90％，N2+-IDA-SepharoseFastFlow对该融合蛋白的吸附容量为30.4mg/mL树脂。
从His-hepcidin制备hepcidin采用先形成二硫键再切除担体蛋白的方式进行。His-hepcidin在胱氨酸/半胱氨酸氧化还原体系中氧化形成二硫键，在0.3mmol/L胱氨酸，3mmol/L半胱氨酸、3mol/L尿素、pH8.5的溶液中以50μg/mL的蛋白浓度氧化40小时。二硫键形成后所得到的单体蛋白可占总蛋白含量的63％。氧化后的蛋白以IMAC吸附进行浓缩。然后采用SephacrylS-100HR在8mol/L尿素的变性条件下凝胶过滤得到只含分子内二硫键的单体蛋白。分离的氧化单体蛋白采用连续稀释复性，首先将氧化单体蛋白稀释至100μg/mL蛋白浓度和4mol/L的尿素浓度，然后在8～10h内连续稀释至2mol/L尿素浓度完成复性，复性后得到的蛋白完全可溶，无沉淀生成。复性完成后的单体蛋白采用IMAC进行浓缩。然后用SephadexG-25柱去除蛋白溶液中咪唑，同时更换缓冲液。
采用肠激酶切割以去除担体蛋白得到hepcidin。确定的酶切反应液组成为：2mol/L尿素、100mmol/LNaCl、25mmol/LTris-HCl、pH7.8～8.0。融合蛋白浓度为lmg/mL，肠激酶用量为1U/200ug融合蛋白。酶切反应在37℃进行12h。酶反应后的担体蛋白以IMAC吸附去除，吸附在螯合树脂上的hepcidin采用100mmol/L的咪唑洗脱得到。最后将hepcidin通过反相色谱进行纯化，得到了具有明显抗菌生物活性的重组hepcidin。
肝脏表达;半胱氨酸;抗菌肽类;基因工程;分离纯化
北京化工大学
硕士
生物化工
袁其朋
2006
中文
Q789
69
2006-11-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）