氧化亚铁硫杆菌遗传多样性及比较蛋白质组学研究
T.f菌(氧化亚铁硫杆菌)是主要的浸矿细菌之一，为了探讨T.f菌浸矿机理，提高生物浸出的效率，本文从T.f菌的遗传多样性及比较蛋白质组学等方面做了系统的研究。
本研究采用RAPD分子标记技术对7个不同来源的T.f菌菌株的遗传多样性进行了研究。首先采用正交实验方案对影响RAPD实验的一些影响因素如Mg2+浓度、TAQ酶的用量等进行了优化，从而保证了RAPD反应的稳定性和可重复性。通过T.f菌的RAPD分子标记的研究，发现来源不同的T.f菌菌株之间存在较大的差异性，最大的相关系数是82.93％，最小的相关系数是44.44％。对T.f菌的氧化活性的测定也发现不同的菌株之间存在较大的差异，其中城门山T.f菌菌株活性最强，作为后面的试验菌株。
通过测定不同培养条件下的T.f菌的生长曲线，揭示了分别在以单质硫、Fe2+及磷酸盐缺失条件下T.f菌菌株的生长规律。使用pH2.0的9K基本培养基，在30℃条件下置培养箱充气培养，记录不同时间点的活菌数。研究表明，T.f菌和其它细菌培养相似，也有静止期、对数生长期、稳定期和衰老期。在以Fe2+为营养源的培养条件下，氧化亚铁硫杆菌的生长对数期为培养的第10～32hrs，T.f菌的最高浓度可达1×107.5cells/ml，在对数生长期，T.f菌复制一代所需的时间约为1.59hrs；磷酸盐缺失条件培养的T.f菌的对数期为第20～60hrs间，T.f菌的最高浓度只有约为1×105.5cells/ml，T.f菌复制一代所需时间约为3.48hrs；在单质硫上培养的T.f菌其对数期处于第4～12days之间，菌的浓度最高可达1×107.5cells/ml，细菌复制一代所需时间约为11.91hrs。
研究了不同营养源培养对于T.f菌浸出金属硫化矿的影响，发现营养源不同，所培养的T.f菌浸出金属硫化矿的活性也存在明显差异。研究了不同浓度的甲硫氨酸、L-半胱氨酸对细菌浸出金属硫化矿的影响，发现在一定的浓度下L-半胱氨酸能够促进T.f菌浸出金属硫化矿；而甲硫氨酸会抑制金属硫化矿的生物浸出。这是由于L-半胱氨酸具有一个巯基基团，能够与金属硫化矿发生反应生成多硫化合物，从而促使金属硫化矿解离。研究了金属离子Cu2+、Cd2+等对T.f菌浸出金属硫化矿的影响，发现这两种金属离子都在不同程度上抑制了金属硫化矿的细菌浸出；但在对野生T.f菌用不同金属离子驯化后，发现在对应的金属离子浓度下，反而会促进金属硫化矿的细菌浸出。这些工作为后面进一步开展比较蛋白质组学的研究提供了思路并奠定了基础。
我们对双向电泳中的8000伏聚焦时间、干胶条pH范围的选择、蛋白上样量等进行了优化。发现选用pH4-7范围的干胶条在8000伏电压下聚焦5hrs，并且上样量＞400μg时，T.f菌的分离效果好，所分离的蛋白质点约为540个左右。我们也对染色的方法作了比较，发现“Silverblue”胶底考染的方法在上样量为900μg时，也能取得较好的效果，而且考染对后面蛋白质质谱的鉴定较银染而言有更好的兼容性。
运用蛋白质组学的方法，对磷酸盐缺失条件培养的T.f菌进行了比较蛋白质组学研究。首先，采用双向电泳的方法分离蛋白，结合MALDI-TOF/MS(基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱)对分离蛋白进行鉴定。采用pH3-10的胶条与pH4-7的胶条分别进行第一向等电聚焦，12.5％SDS-PAGE进行第二向电泳，得到了分辨率和重复性较好的对照组T.f菌和磷酸盐缺失培养的T.f菌总蛋白的双向电泳图谱，并用PDquest软件对它们进行了图像分析，在银染的双向胶上，可分辨540±15个蛋白点，发现了70多个差异蛋白质点，其中21个在磷酸盐缺失条件下是表达上调的，50个在磷酸盐缺失培养条件下是表达下调的。从胶上切下10个差异表达的蛋白点，经胰蛋白酶酶解后，MALDI-TOF质谱测定结合Mascot基因组数据库搜索，鉴定出6个差异表达蛋白质点。通过对已鉴定的蛋白进行功能分析，发现了一些与磷酸盐缺失相关的蛋白，这包括与细胞的氧化磷酸化相关的NADH脱氢酶，与磷酸戊糖代谢相关的转醛酶，以及含AP2域的转录因子等。针对双向电泳难以分离低分子量的小蛋白(特别是10kDa以下)的缺点，本论文采用三种SELDI蛋白质芯片对T.f菌表达谱的低分子量区域进行了初步的研究，并在6360.18～15659.51Da范围内发现共有13个差异表达的小蛋白。
采用差异蛋白质组学的方法，对不同营养源(单质硫和Fe2+)培养的T.f菌的差异表达谱进行了研究。双向电泳结果的分析表明约有80个差异蛋白出现，其中在单质硫培养条件下表达上调的有45个，表达下调的有36个。通过MALDI-TOF-MS和ESI-MS/MS(电喷雾串连质谱)技术共鉴定出20个蛋白，其中大小为46kDa的细胞色素C和细胞色素氧化酶Ⅱ在Fe2+的氧化中起作重要的作用；有ATP合成酶的α链、β链，有双重ATP酶域ABC载体的ATP酶成份。另外还发现差异表达的与脂肪酸代谢相关的酶：Acyl-coA脱氢酶(脂酰辅酶A脱氢酶)、Enoyl-CoA水合酶、长链脂肪酸－辅酶A连接酶(fadD-4)等并进行了功能上的分析。同时也采用了三种SELDI蛋白质芯片研究不同营养源培养的T.f菌差异表达谱的低分子量区域，发现在分子量范围5642.43～20887.64Da之间共有35个蛋白出现差异。
氧化亚铁硫杆菌;浸矿细菌;生物浸出;比较蛋白质组学;电喷雾串连质谱;蛋白质组学;金属浸出;蛋白质;半胱氨酸
中南大学
博士
微生物学
胡岳华
2005
中文
TD853.37;TF803.21;Q939.11
125
2006-08-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）