达坂喜盐芽孢杆菌D-8<'T>四氢嘧啶合成基因的克隆、功能表达和谷氨酰胺转运蛋白基因的克隆
达坂喜盐芽孢杆菌D-8T分离自我国新疆地区达坂盐湖，属于革兰氏阳性中度嗜盐菌。根据革兰氏阳性菌四氢嘧啶合成基因ectABC的蛋白氨基酸的保守序列，设计了AP1和BP2以及BP1和BP2两对简并引物，以菌株D-8T基因组DNA为模板进行PCR扩增后，经过序列测定和Blastx比较，获得了ectABC基因的部分DNA片段。然后将经过地高辛标记试剂盒标记的ectA-ectB探针，与菌株D-8T基因组DNA进行Southern杂交。经过两次反向PCR，获得了11.2kbDNA片段。对该序列进行ORF编码框分析，结果表明存在7个方向不一致的ORF编码框，依次为orf1、orf2、ectA、ectB、ectC、orf3和orf4。被预测的的氨基酸数目分别是398、300、184、428、129、163和361个氨基酸，其对应的蛋白分子量依次为43508、33956、20921、46969、14956、18369和42186Da。分析表明启动子可能的-10和-35区与大肠杆菌的σ70因子依赖的启动区有很大的相似性，而控制全细胞抗性压力的σB因子在菌株D-8TectABC基因上游的启动区中却没有被发现。ectABC基因在结构上比其它物种的更加紧凑。把重组质粒pMXB10ectABC转化到大肠杆菌ER2566中，在LB培养基中，于25℃条件下培养4小时后，用IPTG进行诱导过夜，然后提取细胞内的相容性溶质。13cNMR检测发现在图谱上存在四氢嘧啶相对应的波峰。
本实验设计了一种适合菌株D-8T生长的合成培养基(SSDM)，该菌株在SSDM生长的总盐浓度范围约为3％到20％，其最适宜的总盐浓度为5％到15％。实验发现，菌株D-8T最适合的碳源为甘油和葡萄糖，而蔗糖、甘氨酸甜菜碱、山梨糖、脯氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺等有机物质也可以作为碳源。通过13CNMR检测，发现D-8T菌株在含10％盐度的SSDM、含15％盐度的SSDM、M63和G10中能够合成丙氨酸、谷氨酸和乙酰鸟氨酸等相容性溶质，其中在G10生长的细胞内发现含有四氢嘧啶的微弱信号。该菌分别在含5％和10％盐度受到渗透冲击2小时后，其细胞内积累的主要相容性溶质是谷氨酸和乙酰鸟氨酸。
为了研究菌株D-8T的谷氨酰胺转运蛋白系统，经过两次反向PCR，获得了glnABC转运蛋白基因转运蛋白的基因和可能的启动区，共2.65kb的DNA片段，其中glnA(798bp)编码谷氨酰胺ABC转运系统中的结合蛋白，含有265个氨基酸序列，蛋白质分子量为29382；glnB(657bp)编码谷氨酰胺ABC转运系统的透性酶，含有218个氨基酸，蛋白质分子量为24474；glnC(723bp)编码编码谷氨酰胺ABC转运系统的ATP-结合蛋白，含有240个氨基酸序列，蛋白质分子量为26435。采用软件分析菌株D-8T、克劳氏芽孢杆菌，Oceanobacillus.iheyensis和大肠杆菌k-12之间的氨基酸序列的同源性，发现菌株D-8T中的GlnABC转运蛋白总体上与革兰氏阳性菌同源性比革兰氏阴性菌高。通过互联网对GlnABC蛋白分别进行了氨基酸疏水性分析，发现GlnA蛋白的N端存在1个疏水区，而GlnB蛋白的N端存在4个疏水区，说明GlnA蛋白与GlnB蛋白可能是2个跨膜蛋白。比较GlnA蛋白与GlnB蛋白跨膜区的氨基酸组成，从其蛋白质二级结构分析来看，它们的跨膜区都是由α螺旋组成的。而GlnC属于可溶性蛋白，存在于细胞质中。
谷氨酰胺;达坂喜盐芽孢杆菌;四氢嘧啶;核磁共振;氨基酸;基因克隆;嗜盐菌
中国农业大学
博士
微生物学
杨苏声
2005
中文
Q936;Q933
109
2006-08-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）