多年生黑麦草人工诱发变异的多态性分析与鉴定
多年生黑麦草(LoliumperenneL.)属于禾本科(Gramineae)早熟禾亚科(Pooideae)早熟禾族(Poeae)，是一种重要的冷季型草坪草和牧草草种。但其存在着叶片质地不够细腻、在北方地区越冬能力差以及抗旱耐盐碱能力差等缺点，这大大地限制了它的应用范围。为了发掘新的种质资源，以对现有多年生黑麦草品种进行改良，本文建立了高效的组织培养再生体系，在此基础上研究了其体细胞无性系变异的多态性，同时探讨了多年生黑麦草的辐射诱变效应，并对辐射诱发叶片条状失绿变异株进行了分析与鉴定。主要研究结果如下：
1、建立了高效的多年生黑麦草组织培养再生体系：
愈伤组织诱导培养基为N6+2，4-D10.0mg·L-1(单位下同)+6-BA0.5+NAA0.5+CH(水解酪蛋白)500；继代培养基为N6+2，4-D5.0+NAA0.5+6-BA0.5+CH300；分化培养基为N6+6-BA1.0+KT0.5；壮苗培养基为N6；生根培养基为1/2N6+NAA0.2；以上培养基中除生根培养基蔗糖含量为3％以外，其余均为5％，琼脂含量为6.5％，pH5.8。本体系的愈伤诱导率可达85％，分化率可达77.73％，成苗率达100％，可为多年生黑麦草的生物技术育种提供技术平台。
2、研究了体细胞无性系变异的多态性
(1)观测表明，再生植株群体在叶形、叶色及开花类型等方面都表现出丰富的多态性，出现了浅绿、嫩绿、绿、深绿、墨绿等具不同叶色的植株，并有不需春化就能开花的特殊生理类型。
(2)核型分析表明，其核型公式为2n=2x=14=2sm+12m(2SAT)。再生植株及实生苗的倍性水平分析结果表明，二者所有植株的二倍体细胞均占60.6％以上，为二倍体类型植株。但实生苗根尖细胞染色体数目变异率为12％，变异类型有亚单倍体、单倍体、超二倍体。而组织培养再生苗根尖细胞染色体数目变异率为40％，变异类型除了有亚单倍体、单倍体和超二倍体之外，还有亚二倍体，并出现了四倍体及超四倍体类型。再生植株不仅染色体结构出现了染色体断片、染色体凝聚、染色体倒位等多种类型的变异；而且细胞有丝分裂异常，如染色体桥、染色体不均等、落后染色体等现象也很丰富。丰富的染色体数目变异、结构变异与细胞有丝分裂异常证明再生植株具有非整倍化和多整倍化的趋势。
(3)利用RAPD技术检测了再生植株的多态性。筛选出11个随机引物对多年生黑麦草进行扩增，其中4个引物检测到了再生植株的多态性，其多态率在5.8％至15.4％之间。这说明多年生黑麦草再生植株DNA水平上不仅存在广泛的体细胞无性系变异，而且再生植株间变异位点也存在差异，因此证明再生植株群体具有从中选择不同新种质的潜力。
多年生黑麦草广泛存在的体细胞无性系变异，包括形态变异，染色体变异，DNA水平的变异等，充分说明体细胞无性系变异是进行多年生黑麦草新种质选择的丰富变异源泉之一。这为利用组织培养方法进行多年生黑麦草的种质资源创新和新品种培育提供了理论依据。当然，体细胞无性系变异无疑降低了无性系的遗传稳定性，因此在利用组织培养技术为平台进行植物基因工程等研究时，一定要尽量避免体细胞无性系变异的发生。
3、研究了辐射诱变效应，并对变异株进行了分析与鉴定
(1)从辐射对种子发芽率、幼苗根长、幼苗苗长的影响来看，50Gy的60Co-γ辐射剂量有一定的促进作用，100Gy的辐射剂量对种子发芽、幼苗早期的根系和苗生长均有明显的抑制作用，250Gy以上的辐射剂量与低剂量间对种子发芽率、幼苗根长及苗长的影响差异极显著，而根据线性回归方程得出多年生黑麦草的半致死剂量为342Gy，因此对多年生黑麦草的干种子进行60Co-γ辐射的适宜剂量在250～350Gy。
(2)γ射线辐射后，可观测到的形态变异主要有植株矮化和叶色变异，其中值得注意的是叶片条状失绿变异，包括黄绿型与绿白型两类型。变异株的叶绿素a和叶绿素b含量下降17.7％至48.6％，但是黄绿型变异株叶绿素a与叶绿素b的比值分别上升17.5％和22.5％，说明其叶绿素a与叶绿素b下降的速度不同步，叶绿素b下降的幅度较大。以上结果说明，虽然变异株都属于叶绿素缺乏型突变，但黄绿型属于低叶绿素含量突变体。黄绿型的净光合速率分别下降73.7％和29.34％，而绿白型的净光合速率没有表现出下降的趋势，说明两类型变异株的光合能力不同，同时说明叶绿素下降并未影响绿白型变异株系的光合能力。两类型变异株过氧化物酶同工酶谱带均发生带缺失或新特异条带出现的现象，这可能是基因突变或是基因差异表达的结果。AFLP标记没有检测到变异的位点，可能与AFLP标记的局限性和多年生黑麦草基因组的庞大有关，或是突变并非发生在核DNA。
以上研究既为人工诱变育种提供了理论依据，也为新品种选育提供了技术支持。
多年生黑麦草;体细胞无性系变异;辐射诱变;黑麦草;体细胞;再生植株
中国林业科学研究院
博士
森林培育
彭镇华;孙振元
2005
中文
S543.6;S722.35
90
2006-08-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）