毛白杨纤维素合成酶基因的克隆及功能鉴定
本研究以毛白杨次生木质部为材料，通过RT-PCR克隆了纤维素合成酶PtoCesA1全长基因和PtoCesA2，PtoCesA3的基因片段，利用转基因手段，获得了各基因的转基因植株，根据转基因植株的表型，分析了各基因的功能及其相互作用关系，研究的主要结果有：
1)以毛白杨次生木质部区域的组织为材料提取RNA，合成双链cDNA，并克隆出毛白杨纤维素合成酶全长基因(PtoCesA1)。序列分析表明该基因长度为3215bp，与已报道的欧洲颤杨的ptrCesA1基因的同源性为98％。具有开放的阅读框，编码区在52-2985碱基之间，长度为2925bp。
2)设计与植物表达载体pBI121多克隆位点相匹配的双酶切位点引物，将PtoCesA1不同区段的基因片段PR，PF，CC1，BR反向连接到pBI121载体上，构建了pBIPF，pBICC1，pBIPR，pBIBR四个反义表达载体。利用根癌农杆菌介导方法分别转化烟草和杨树，获得杨树转基因植株和烟草转基因成熟植株。其中pBIPF转基因烟草表型与对照相同；而pBICC1，pBIPR，pBIBR转基因烟草表型发生了明显的变化，表现为成熟植株瘦小，次生木质部厚度和纤维细胞壁厚度减小以及茎纤维素含量下降等特征，CC1，PR，BR片段的反义表达抑制了纤维素的生物合成而抑制了烟草的正常生长，尤其是木质部的发育，说明PtocesA1的基因功能是参与次生木质部次生壁的纤维素的合成，；此外，这三个表达载体的转基因烟草之间的表型差异不显著，说明在本试验中基因片段的长度对其反义转基因烟草的表型影响不显著。
3)通过同义突变引入BamHI酶切位点，分两步构建了全长PtoCesA1的正义表达载体pBIPA1，并通过根癌农杆菌介导转化烟草和杨树，获得了杨树转基因植株和烟草成熟植株。转基因烟草表现为植株明显变矮，叶片变小，木质部厚度，纤维细胞壁厚度减少。pBIPA1转基因烟草的表型与PtoCesA1的反义转基因烟草之间的表型差异不显著。
4)以毛白杨次生木质部cDNA为模板，克隆PA2(PtoCesA2)和PA3(PtoCesA3)基因片段(815bp和381bp)。两个片段与欧洲颤杨中PtrCesA2和PtrCesA3的同源性高达98％。并利用PA2和PA3片段分别构建了反义表达载体pBIPA2和pBIPA3。此外，利用中间载体构建了PA2和PA3片段反向串联表达载体pBIPA2+PA3。并用根癌农杆菌介导方法将三个表达载体分别转化烟草和杨树，获得转基因杨树植株和烟草成熟植株。转基因成熟烟草都表现为植株瘦小，叶片变小，次生木质部厚度和纤维细胞壁厚度减小。3个反义表达载体抑制了转基因烟草的生长，尤其是木质部的发育，说明PtoCesA2，PtoCesA3的功能是参与杨树次生木质部的发育，特别是纤维细胞次生壁的纤维素的生物合成。
5)对PtoCesA1，PtoCesA2，PtoCesA3反义转基因烟草进行表型比较分析，结果表明三个基因的反义转基因烟草的表型相似，各项测定指标间差异不显著，说明三个基因编码蛋白可能是同一个纤维素合成酶复合体的不同组成部分。反义敲除其中任何一个基因，都是阻止同一个纤维素合成酶复合体的形成，因而三个基因的反义转基因烟草的表型相似。该试验结果为揭示PtoCesA1，PtoCesA2和PtoCesA3的相互作用机制提供了重要的实验证据。本试验首次利用基因工程研究林木纤维素的生物合成机理并取得了重要进展，为进一步研究林木纤维素的生物合成机制提供了新的研究思路和方法。
毛白杨;纤维素合成酶基因;基因克隆;转基因植株
中国林业科学研究院
博士
林木遗传
张守攻;齐力旺
2005
中文
S792.117;S718.46
117
2006-08-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）