NUDC与血小板生成素受体之间相互作用及其活性的研究
血小板减少症是一种严重的疾病，过去主要是先天性遗传病，近年来随着放疗和化疗的癌症病人的增多而逐年增加。一直以来治疗血小板减少症的方法主要是血小板输注法。血小板生成素(Thrombopoitin，TPO)的发现为治疗血小板减少症提供了新的途径。TPO是刺激巨核细胞增殖和分化的主要细胞因子，其在体内可明显刺激血小板生成，但不幸的是在临床应用时发现体内注射TPO容易产生中和抗体并有其他副作用。
为了寻找能够治疗血小板减少症的新药，本论文以血小板生成素受体的胞外区(Mpl-EC)为钓饵，筛选人体胎肝酵母双杂交cDNA文库，从5×106个酵母转化子中只获得了人核迁移蛋白(hNUDC)，说明该蛋白能够与Mpl-EC在细胞内特异结合。进一步用pull-down实验在细胞外检测Mpl-EC与hNUDC的相互结合。首先用MBPpull-down实验检测两种蛋白在细胞外的相互作用。将两种融合蛋白，组氨酸融合蛋白His-hNUDC和麦芽糖融合蛋白MBP-Mpl-EC，在大肠杆菌中水溶性表达。MBPpull-down实验表明MBP-Mpl-EC和MBP都能与His-hNUDC在麦芽糖亲和层析柱上共洗脱，说明MBP能够与His-hNUDC非特异结合。由于MBPpull-down实验不能确定hNUDC与Mpl-EC的特异相互结合，因此改用GSTpull-down实验检测融合蛋白GST-Mpl-EC与His-hNUDC在细胞外的相互结合，实验证实His-hNUDC能够与GST-Mpl-EC在谷胱苷肽亲和层析柱上共洗脱，而不与阴性对照GST共洗脱，说明两种蛋白hNUDC与Mpl-EC在细胞外存在特异的直接的相互作用。以上实验在细胞内细胞外证实了hNUDC与Mpl-EC两种蛋白的特异结合，说明hNUDC可能是Mpl的一枚新配体。
进一步用酵母双杂交的方法检测蛋白参与结合的关键位点。首先用缺失突变研究Mpl-EC和hNUDC相互作用的活性部位，检测发现Mpl-EC参与结合的活性区域位于Mpl-EC的26-277氨基酸区，hNUDC参与结合的活性部位位于100-238氨基酸区。进一步构建hNUDC活性部位的酵母双杂交PCR随机点突变库找出蛋白参与结合的关键位点，用酵母双杂交系统发现hNUDC的E114，I202，E226的位点是影响hNUDC与Mpl-EC结合的关键位点。
hNUDC与Mpl-EC两种蛋白的特异结合提示NUDC可能在巨核细胞的发育过程中有重要作用。考虑到不同物种之间蛋白序列差异可能造成其生物反应活性降低，用RT-PCR的方法克隆小鼠同源基因mnudc，以Balb/c小鼠为动物模型，检测小鼠NUDC(mNUDC)在巨核细胞发育中的作用。将mnudc构建到原核表达载体中，将其在大肠杆菌中诱导表达和亲和纯化，获得大量的融合蛋白His-mNUDC。体外无血清液体培养检测His-mNUDC对小鼠巨核细胞增殖的作用，乙酰胆碱酯酶染色发现His-mNUDC作用下的小鼠巨核细胞数量增多，且巨核细胞体积增大。免疫荧光染色观察发现加入His-mNUDC培养的小鼠巨核细胞核多倍体明显增加(主要是8N和16N)，高倍光学显微镜下观察发现产血小板的巨核细胞明显增多。以上结果说明His-mNUDC能够刺激巨核细胞的增殖、分化和成熟。His-mNUDC和亚剂量的TPO(20ng/mL)同时作用能显著刺激小鼠巨核细胞的增殖。0.25μg/mL的His-mNUDC与TPO同时作用下产生的巨核细胞数比TPO单独作用下产生的巨核细胞数增加90％，该结果表明在体外His-mNUDC能够与TPO协同作用显著刺激小鼠巨核细胞的增殖，即mNUDC与TPO之间的相互关系是协同作用而不是竞争关系。体内连续7天腹腔注射大肠杆菌中表达的融合蛋白His-mNUDC，实验结果表明His-mNUDC能增加正常小鼠的外周血血小板数，外周血血小板数在第10天达到最高值。通过测试不同剂量的实验组(2.5μg/kg/d，10μg/kg/d，20μg/kg/d，50μg/kg/d)，发现20μg/kg/d的His-mNUDC剂量组刺激外周血小板生成的作用最明显，与空白对照组相比血小板数最高可增加86.2％。
综上所述，hNUDC能够与Mpl-EC特异结合，并在巨核细胞成熟和产板中有重要作用。hNUDC是继血小板生成素TPO发现之后的又一血小板生成素受体Mpl的新型配体。虽然还存在非Mpl依赖的血小板生成途径，该配体的发现将解释TPO缺陷型小鼠中为何仍有残留的血小板。hNUDC与Mpl-EC的特异结合及其刺激血小板生成的作用提示，hNUDC有可能成为治疗血小板减少症的新希望。
血小板生成素受体;新型配体;巨核细胞;蛋白相互作用;血小板减少症
中山大学
博士
遗传学
徐培林
2005
中文
R558.2;R973;R968
125
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）