GGNBP1和GGN2在小鼠睾丸中的表达及相互作用研究
原始生殖细胞(PGC)是成年性腺生殖细胞的始祖细胞。一种胚胎期生殖腺内PGC严重缺乏的生殖细胞缺失(germcell-deficient，gcd)突变是外源基因插入失活FancL所致的隐性遗传性变异，导致成年雌雄鼠不育。胚胎期FANCL与原始生殖细胞增殖密切相关，成年睾丸中FANCL与几个睾丸生殖细胞特异性蛋白质相互作用可能影响精子的生成。以FANCL蛋白为诱饵蛋白，通过酵母双杂交实验发现了配子生成素基因Ggn。Ggn基因至少有10多种不同的拼接方式，预期编码GGN1、GGN2和GGN3三种蛋白。同样，通过酵母双杂交系统发现了与GGN1相互作用的配子生成素结合蛋白1(GGNBP1)。本课题旨在通过制备GGN2、GGNBP1和FANCL抗体，利用特异性抗体作为蛋白质研究的有效工具进行体内表达和相互作用研究，以探索它们在精子生成中所发挥的功能。
首先，通过克隆表达FANCL和GGNBP1蛋白以及人工合成GGN2短肽获得抗原，皮下注射免疫家兔制备多抗血清。制备抗体亲和层析柱亲和纯化抗体。其次，利用纯化抗体通过Westernblotting方法分析小鼠多种组织匀浆蛋白。首次证实小鼠体内确实存在FANCL、GGNBP1和GGN2蛋白。FANCL在小鼠组织细胞中广泛表达，而GGN2和GGNBP1则是小鼠睾丸特异性表达的蛋白质。
第三，提取小鼠多种组织细胞总RNA，Northernblotting分析表明Ggn和Ggnbp1也都是小鼠睾丸特异性转录基因。
第四，在NIH3T3细胞中将带绿色荧光蛋白标签的EGFP-GGN1和EGFP-GGN2分别与带Myc标签的Myc-GGNBP1共表达，进行细胞免疫荧光共定位实验表明GGNBP1与GGN1和GGN2之间相互作用。采用酵母双杂交体系证实了它们之间的相互作用关系。
第五，Superdex200分子筛凝胶层析小鼠睾丸匀浆蛋白，分段收集后经亲和纯化抗体的Westernblotting分析显示FANCL、GGN2和GGNBP1蛋白共同分布在大小约230KDa的收集管内，表明小鼠睾丸细胞中FANCL、GGN2和GGNBP1共同存在于一个大约230KDa的复合物内。
最后，细胞共定位研究发现EGFP-GGN2集中分布于细胞泡状结构小体上。进一步发现EGFP-GGN2蛋白与内质网蛋白SEC-23和CALNEXIN细胞共定位，这两种内质网蛋白与胞内小泡转运有关，因此认为瞬时表达的EGFP-GGN2蛋白是膜蛋白可能参与细胞的小泡运输；瞬时表达的EGFP-GGNBP1蛋白在胞质内沿质膜分布，且集中分布在高尔基体上。超声破碎小鼠睾丸细胞后高速离心分离膜蛋白和胞质蛋白，用亲和纯化抗体进行Westernblotting印迹分析，结果证实在生理状态下体内的GGN2和GGNBP1蛋白也是膜蛋白。
本课题研究首次证实体内确实存在FANCL、GGN2和GGNBP1蛋白，FANCL在小鼠组织细胞中广泛表达，这与其参与DNA损伤修复的重要功能有关。FANCL、GGNBP1和GGN2共同存在体内一个大约230KDa的复合体内。GGN2和GGNBP1是睾丸特异性表达的膜蛋白，GGNBP1是高尔基体相关蛋白，GGN2是内质网膜泡状结构蛋白，GGN2和GGNBP1以及GGN1可能参与精子生成过程中的顶体形成。
GGN2抗体;GGNBP1抗体;FANCL;精子生成;顶体形成;蛋白质
解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院
博士
遗传学
黄培堂;卢柏松
2005
中文
Q954.434;Q71
111
2006-06-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）