CHO-dhfr<'->细胞改造的研究
CHO-dhfr-细胞表达体系是重要的药用蛋白表达体系，但其在培养过程中存在着一系列的问题，为了使其具有更适应大规模培养的特性，我们利用Flp定点整合系统，通过在CHO-dhfr-细胞中稳定整合调控基因对CHO-dhfr-细胞进行了的改造。首先在CHO-dhfr-细胞中定点整合并过表达人抗凋亡基因Bcl-2，获得的重组细胞对诱导凋亡因素的耐受能力增强，凋亡水平降低，增加了对无血清和高氨离子浓度不利培养条件。乳酸是细胞的重要代谢产物，其积累可明显影响细胞的生长和对外源蛋白的表达。为了减少细胞内乳酸的积累，选择了四个CHO-dhfr-细胞LDH-A基因中RNAi位点，设计了可转录产生相应shRNA片段的DNA序列，克隆于表达载体pAV/U6的下游。通过将shRNA表达载体在CHO-dhfr-细胞中稳定整合使之持续表达针对CHO-dhfr-细胞LDH-A基因的shRNA，在建立的四株重组细胞中，筛选到一株具有较低的乳酸脱氢酶的mRNA的细胞株，获得的重组细胞株CHO-shRNA能降低乳酸的产生和在培养基中的积累，使细胞的凋亡水平降低，提高了细胞贴壁培养密度11.4％。我们的第三方面工作是实现对细胞增殖进行调控，因为细胞在培养过程中的过度增殖不利于外源蛋白的产生，当细胞达到最佳密度后，生长的停滞将有利于提高外源蛋白的生产。为了实现对细胞生长调控蛋白P27表达的调控以实现细胞生长的停滞，利用T-RExTM(四环素诱导)诱导表达系统，通过两步重组来达到建立稳定整合并可诱导表达p27基因的重组细胞株的目的，首先筛选了高表达TetR的重组细胞株，在此基础上，定点整合了受TetO2调控之下的p27基因，以实现对p27基因的诱导表达和对细胞周期的控制，在p27诱导表达的情况下，有效的抑制细胞周期停滞于G1期，通过对EGFP检测，表明在细胞生长停滞条件下，细胞对外源蛋白的表达水平可提高70％。
CHO-dhfr细胞;细胞培养;细胞凋亡;乳酸;增殖抑制
解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院
博士
遗传学
俞炜源
2005
中文
Q813.11;Q343.3
65
2006-06-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）