鸡胚胎原始生殖细胞的体外培养及嵌合体鸡的制备和分子鉴定
转基因研究是近年来生命科学研究中热门、发展快的领域之一。相对于哺乳动物受精卵，鸟类的受精卵大且含大量卵黄，操作比较困难。人们寻找了另外一种细胞——PGCs细胞(primordialgermcells，PGCs，原始生殖细胞)代替受精卵作为转基因鸟类的载体。PGCs容易操作，在雌性中它最终发育为卵细胞，在雄性中最终发育为精子。PGCs在胚胎中的迁移途径——通过血液循环后移植入性腺，使它能成为冷冻保种的目标细胞，同时成为转基因鸟类制备中的良好载体。
本实验用40-60μm的玻璃针从孵化51-53小时的鸡胚卵黄静脉中取血，经Ficoll密度梯度离心纯化血液中的PGCs细胞，通过形态和过碘酸-希夫试剂染色鉴别，其纯度可达75％左右。同时分离孵化5天的鸡胚性腺细胞为基质细胞，在添加多种生长因子(胰岛素样生长因子IGF-1、碱性成纤维细胞生长因子b-FGF、白血病抑制因子LIF)的条件下培养PGCs细胞，探索其体外培养的最佳条件。
本研究以广东石歧杂鸡为提供PGCs细胞的供体鸡，以荷兰H系鸡为接受供体PGCs细胞的受体鸡。通过显微注射的方法，将冻存复苏后的PGCs供体细胞，浓缩至400个左右/μl，取1-1.5μl注入孵化60-64小时的受体鸡胚血液中。接受了供体PGCs细胞的受体鸡胚继续孵化。后提取受体鸡胚基因组DNA进行AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP，扩增片段长度多态性)分子鉴定，测定实验后的鸡是否为嵌合体鸡及其嵌合率的指标。结果显示：制备的出壳前即死亡的36个受检鸡胚中，13个受检鸡胚为嵌合体，嵌合率达36％。存活至出壳的8个鸡胚，都为弱雏，AFLP分子鉴定3个为嵌合体，嵌合率为37.5％。
本研究建立了分离PGCs、体外培养PGCs、制备嵌合体的方法，不仅可以提供丰富的供体细胞来源，有利于PGCs体外的遗传操作，还为转基因鸡的成功制备创造条件。冷冻保存PGCs可以用于地方鸡种的保种，尤其是一些濒临灭绝的物种遗传资源的保存。
鸡;原始生殖细胞;显微注射;嵌合体;扩增片段长度多态性
南京师范大学
硕士
细胞生物学
李震;曹祥荣
2005
中文
S831.2
63
2006-06-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）