猪α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达
干扰素(Interferon，IFN)是一类重要的细胞因子，具种属特异性，在同种细胞上具有广谱的抗病毒、抗细胞增殖、免疫调节等多种生物活性。其中IFN-α/β是机体的第一抵御病毒体系。猪是一种重要的经济动物，因此采用重组DNA技术生产猪α干扰素作为免疫增强剂和免疫治疗剂无疑有重要意义。本文成功实现了Po-IFNα在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中的高效分泌表达。
Pichiapastoris表达系统是近年来迅速发展起来的一种真核表达系统。Pichiapastoris是一种甲醇酵母，可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长。在表达真核细胞外源蛋白时，不仅具有原核生物生长快、操作简便、成本低的特点，又具备哺乳动物的翻译后加工修饰的功能，从而表达有生物活性的外源蛋白。
本研究以含有强启动子PAOX1和α-factor信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体质粒pPICZαA，构建猪IFNα基因的重组质粒pPICZαA-IFNα，并转入E.coliJM109中，得到转猪IFNα基因工程菌，经酶切鉴定克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为猪IFNα基因。通过电击将经SacI酶切后线性化的pPICZαA-IFNα质粒转化到巴斯德毕赤酵母KM71H中，经ZeocinTM抗性浓度梯度筛选出高抗性重组菌株，用1％甲醇诱导目的蛋白表达。SDS-PAGE和Westernblot鉴定表达产物的结果表明，分泌于胞外的猪IFNα蛋白分子量比猪IFNα理论值分子量稍大，估计是糖基化的原因。表达的蛋白可发生正确的抗原-抗体反应，表达量为0.45mg/mL。将蛋白表达上清经细胞毒性实验检测表达产物的抗病毒活性为2.5×104IU/mL。
猪α干扰素;巴斯德毕赤酵母;基因重组;胞外分泌表达
南京师范大学
硕士
细胞生物学
曹祥荣;李震
2005
中文
Q786
60
2006-06-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）