沙眼衣原体Omp2的表达、纯化及其单克隆抗体的研制与鉴定
目的：用构建含沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis，Ct)血清型D型外膜蛋白2(outermembraneprotein2，Omp2)167～434位氨基酸编码基因(omp2')的重组表达载体，在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达Omp2重组蛋白；免疫BALB/c雌鼠，研制并鉴定其单克隆抗体，为Ct感染诊断试剂盒研制与其致病机制的研究提供实验依据。
方法：将含重组质粒pET28b(+)/omp2'在原核细胞中用IPTG诱导表达，SDS-PAGE、Westernblot分析和鉴定表达的蛋白；采用强变性尿素溶解包涵体，经过亲和层析法对重组蛋白进行纯化；Bradford法测定纯化的重组蛋白的浓度。采用分步稀释，逐渐降低变性剂的浓度，并在复性缓冲溶液中加入一定量氧化、还原型谷胱苷肽和甘氨酸等，进行复性；用纯化的Omp2重组蛋白(rOmp2’)皮下多点免疫BALB/c雌鼠；无菌操作取其脾细胞，以聚乙二醇作为融合剂，与骨髓瘤细胞融合；有限稀释法进行单克隆化；间接ELISE法筛选阳性克隆；以琼脂糖免疫双扩散法鉴定单抗亚类；间接ELISE法测定腹水效价；细胞涂片染色镜检杂交瘤细胞株染色体数目；流式细胞仪分析杂交瘤细胞DNA含量；Westernblot分析其特异性。
结果：SDS-PAGE分析显示，在IPTG诱导下，基因工程菌表达一相对分子质量(Mr)约为35KDa的目的蛋白，且主要以包涵体形式存在；经亲和层析后可获得纯度在96％左右的重组蛋白。纯化的rOmp2’免疫BALB/c小鼠，经细胞融合，间接ELISA检测，获得1株单抗2C5；亚类鉴定为IgG2b；腹水效价为1：40000以上；杂交瘤细胞株染色体数均数为104，流式细胞仪分析杂交瘤DNA含量基本符合骨髓瘤细胞和脾细胞DNA含量之和，两者均符合杂交瘤细胞的特点；Westernblot试验表明单抗能与纯化的rOmp2'特异性的结合。
结论：成功地得到了纯化、复性和定量的重组蛋白rOmp2’；用rOmp2’免疫BABL/c雌鼠，经细胞融合后用有限稀释法进行单克隆化，获得了一株特异性好，效价高的单克隆抗体2C5。
沙眼衣原体;Omp2蛋白;蛋白纯化;蛋白复性;单克隆抗体
南华大学
硕士
病原生物学
谭立志
2005
中文
Q813.2;R374.1
52
2006-05-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）