羧肽酶B在毕赤酵母中的表达、纯化与活性鉴定
羧肽酶B(CPB)是一类水解蛋白或多肽底物C-端Lys或Arg的金属蛋白酶。当前，羧肽酶B已广泛应用于蛋白质、多肽的末端修饰，急性胰腺炎及胰腺植皮排斥的血清标记，尤其在胰岛素原活化为胰岛素的过程中，羧肽酶B是不可缺少的双酶(胰蛋白酶及羧肽酶B)之一。到目前为止，商业途径获得的羧肽酶B主要从猪胰脏中提取，使得产品价格昂贵，同时也不可避免地混杂有其它蛋白酶，如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶。本研究的目的就是试图以基因工程的方法生产一种高效价廉的重组CPB产品。
本实验通过分析鼠proCPB的基因序列，比较其密码子的组成与酵母偏爱密码子的差异，在引物设计时采用基因改构及密码子优化的策略，对鼠proCPB基因的5'序列进行了优化。实验时以RT-PCR法从SD鼠胰腺细胞中克隆了proCPB基因，将其插入pPIC9载体后，转入毕赤酵母GS115细胞，在醇氧化酶1(AOX1)强启动子的作用下，首次实现了鼠羧肽酶原B蛋白在毕赤酵母中的表达，并在α-因子信号肽的引导下成功地分泌到胞外。通过表达条件的优化，使用BMGY(pH6.0)培养基，添加0.5﹪(m/v)的酪蛋白水解物和3mmol/L的PMSF，于28℃培养，每隔12h补加0.5﹪(v/v)的甲醇，重组酵母GS115-proCPB表达的重组蛋白可达500mg/L以上，表达的目的蛋白占总蛋白的94﹪以上。表达产物经过二步疏水、二步离子交换层析及活化后，每升培养基可获得50mg以上重组CPB产品，得到的CPB纯度达95﹪以上。活性测定表明，重组proCPB活化后的CPB的比活力可达110U/mg(CPB参照品为180U/mg)。稳定性分析表明：重组表达的CPB很稳定，在4℃条件下保存5个月后仍未发生降解，酶的活性仅降低10﹪。
羧肽酶原;毕赤酵母;纯化;胰蛋白酶;重组酵母;基因;偏爱密码子;二步离子交换层析;密码子优化;急性胰腺炎;胰凝乳蛋白酶;胰岛素原;培养基;酪蛋白水解物;活化;产品;金属蛋白酶;定性分析表;重组蛋白;重组表达
西北农林科技大学
硕士
遗传学
陈宏;方宏清
2005
中文
Q786;Q556.9
48
2005-11-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）