亚洲璃眼蜱功能基因的克隆、表达和免疫效果分析
本研究以从本实验室建立的亚洲璃眼蜱雌蜱未吸血和半饱(吸血5天)状态的唾液腺基因表达差异建立的消减文库中筛选出的两个新基因EST片段为对象(根据基因大小分别命名为AP27、AP18)，开展这两个基因的全长克隆、体外表达及免疫工作以分析其功能，为蜱和蜱病的控制作一些探索。
研究首先运用生物软件分析两个EST片段(据测序号分别命名为1-6和B12)的结构，分析出其中一个EST片段(1-6)为一完整基因结构，该基因开放性阅读框含510个碱基，共编码170个氨基酸，预测分子量为18.36Kda,故将其正式命名为AP18；另一基因片段(命名为B12)具有典型的基因3’端特征，而5’端缺失，故根据已有序列设计三条基因特异性引物：GSP1=5’-TGTACTGGAGCATGCAC-3’，GSP2=5’-GAGCACACCGGGTCAGGTCCTTG3’，GSP3=CTTCATCTCGTTGGGTGATC-3’，用于5’-RACE扩增。PCR产物经纯化、连接入pGEM-T质粒载体、转化大肠杆菌DH5α和测序。
其次，运用RT-PCR方法分析AP18、AP27在亚洲璃眼蜱中的分布情况，分别提取亚洲璃眼蜱雌蜱的未吸血成蜱的唾液腺和半饱血成蜱不同部位包括壳、唾液腺、肠的总RNA，取相同量的总RNA进行RT-PCR分析，结果二者在蜱的壳、肠、和吸血时的唾液腺中均有表达，而在未吸血蜱的唾液腺中不表达；且在壳中的表达丰度相较略低。
再分别将两个基因重组入PET28a、PET32a、PGEX-4T系统进行体外原核表达，结果在PET32a中成功表达出AP18基因蛋白，但AP27基因由于某些未知原因，在三个系统中均未能成功表达。
本研究成功地获得了亚洲璃眼蜱的两个新基因的全长，证明这两个基因为亚洲璃眼蜱因吸血诱导唾液腺发生差异表达的基因；也证明了基因来源的消减文库的成功性和可靠性；经原核表达的AP18重组蛋白具有一定的免疫原性，为抗蜱综合疫苗的研制提供了参考。
亚洲璃眼蜱;克隆;基因表达;基因功能;免疫
湖南农业大学
硕士
基础兽医学
刘毅;周金林
2005
中文
S852.74
57
2005-11-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）