融合表达Ag85B-ESAT6的结核病疫苗的构建及其免疫学特性研究
MTB早期培养滤液蛋白(CFP)中的Ag85B和ESAT6是重要的保护性抗原,广泛用于新型TB疫苗研究.该研究先后构建了融合表达Ag85B和ESAT6基因的亚单位疫苗、基因疫苗以及重组BCG疫苗,并比较了各自诱发的细胞免疫应答水平和对感染小鼠的保护力,以期为TB的防治提供新型疫苗.设计了含不同酶切位点的ag85b和esat6引物,采用PCR的方法从MTB毒株H37Rv-DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段,将目的片段与pGEM-T-easy载体连接后测序,PCR获得的ag85b和esat6序列与GenBank报道的完全一致.将测序正确的ag85b和esat6按照不同的酶切位点联合克隆入pProEX HT表达载体,成功诱导表达融合蛋白,同时与6×his的单克隆抗体(mAb)进行Western-blot分析,为了检测融合蛋白免疫小鼠引起的细胞免疫应答,最后一次免疫完成四周后,分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,体外用CFP刺激,结果融合蛋白Ag85B-ESAT6和ESAT6-Ag85B诱导产生的IFN-γ分别为3.51±0.30ng/ml和4.05±0.41ng/ml,显著高于生理盐水对照组(0.5±0.25ng/ml,P<0.05),但不及BCG免疫组(5.55±0.31ng/ml).将ag85b和esat6按照不同的酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3,分别命名为A<,z>-pcDNA3-E<,F>和E<,z>-pcDNA3-A<,F>.将重组质粒A<,z>-pcDNA3-E<,F>和E<,z>-pcDNA3-A<,F>电转CHO细胞,RT-PCR检测融合蛋白mRNA的表达,用间接免疫荧光可以在转染重组质粒的CHO细胞内检测到较强的绿色荧光,证实CHO细胞内融合蛋白的表达.采用PCR方法从MTB毒株H37Rv-DNA扩增出热休克蛋白Hsp60基因及其信号肽序列α-ss,将测序正确的hsp60和α-ss分别克隆入E.coli-BCG穿梭载体pOLYG中,构建分枝杆菌分泌表达载体pDE22,按相应的酶切位点将ag85b和esat6按照不同的连接方式联合克隆入pDE22载体.取基因型和表型鉴定正确的两种重组BCG分别免疫小鼠,四周后,分离脾淋巴细胞,在体外用CFP抗原刺激,一部分用做测定淋巴细胞增殖指数.综上所述,与基因疫苗和亚单位疫苗相比,分泌表达Ag85B和ESAT6融合蛋白的重组BCG免疫,是产生抗原特异性的细胞免疫应答和保护性反应的一种有效方式,该疫苗可进一步用于TB的防治研究.
结核病;疫苗;重组卡介苗;基因融合;Ag85B;EAST6
第四军医大学
博士
病原生物学
徐志凯
2004
中文
R392-33;R521.03
98
2004-12-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）