恶性疟原虫四环素诱导性转基因表达系统的构建与检测
该文拟建立一种抑制型疟疾四环素可诱导转基因表达系统,为研究可能在疟疾预防与治疗中有重要作用的新基因打下基础.但是目前已有的诱导性启动子在疟原虫中不具有功能性,而疟原虫本身又没有诱导性启动子.为构建一个在疟原虫对四环素或其类似物具有可诱导性反应的重组启动子,将7个拷贝的TetO(7-Copy ofTetO,7cot)插入到GBP130启动子单个转录起始位点(Transcriptional Initiation Site,TIS)附近.但由于在该TIS位点附近没有合适的限制性位点可用,首先利用重叠延伸PCR的方法在TIS上下游不同位点(即-5,-2,+2和+5)分别引入一个BamHI位点.以pTL-8为模板PCR扩增出7cot,然后利用其两端的BglⅡ与BamHI连接,分别构建4个反应载体,即pG/7T(-5),pG/7T(-2),pG/7T(+2)和pG/7T(+5).经PCR、限制性酶切和DNA测序分析表明构建完全正确.为鉴定7cot插入GBP130启动子后对启动子活性的影响,上述4个反应载体及其原始载体pGBPCAT△2分别用来电转环状体恶性疟原虫.CATELISA检测表明,4个反应载体中的CAT表达水平均高于pGBPCAT△2,并且7cot的定位越靠近下游CAT表达水平越高.说明7cot插入GBP130启动子后对启动子活性有促进作用,当7cot插入+5时启动子活性最高.因此,载体pG/7T(+5)可用于疟疾四环素可诱导转基因表达系统中的反应载体.为构建调节载体,PCR扩增TetR后克隆入质粒pD的单克隆位点BamHI,其表达由伯氏疟原虫的二氢叶酸还原酶-胸苷合成酶基因的5'和3'侧翼序列控制,构成载体pDT.反应载体和调节载体建成后,将pG/7T(+5)和pDT共转染疟原虫,以脱羟基四环素(Anhydrotetracycline,ATc)进行诱导,鉴定系统的诱导性.CAT检测表明,在ATc加入和不加入的转染组没有明显变化,即没有可调控性变化.为进一步提高报告基因的敏感性,以LUC置换pG/7T(+5)中的CAT,构成pGL(+5),然后与pDT再次进行共转染.诱导剂ATc的使用浓度分别为1μg/mL、0.5μg/mL和0.1μg/mL.LUC活性检测表明仍然没有发现可诱导性反应.推测可能是由于TetR的调控序列源于伯氏疟,在恶性疟中没有转录调控功能;或者是GBP130启动子不适合于恶性疟的四环素可诱导系统;或者是其他可能的但是没有发现的因素.具体原因则有待进一步研究.
疟原虫;恶性;诱导表达;四环素;转基因
第四军医大学
博士
病原生物学
薛采芳
2004
中文
R382.31;R446.5
71
2004-12-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）