棉铃虫细胞色素P450的诱导、纯化及其性质研究
尽管P450s酶系在昆虫中的重要性已经十分清楚,但由于多型P450共存于同一昆虫体中,要真正了解和调控P450的功能,需要剖析不同P450的底物特异性,首先必须分离纯化单型P450,因此P450分离纯化在P450研究中具有重要的意义.棉铃虫是一种在世界范围内普遍发生的重要害虫,能导致多种不同作物的严重损失.为深入了解棉铃虫P450的结构与功能,我们就棉铃虫P450的诱导、分离纯化及性质进行了研究,主要研究结果如下.比较萘、五甲基苯、槲皮素、芸香苷和单宁酸对棉铃虫微粒体P450含量的影响发现;萘和五甲基苯能明显诱导微粒体P450,中肠微粒体P450的含量分别提高了2.60和2.34倍,脂肪体微粒体P450的含量分别提高了2.51和3.15倍.槲皮素、芸香苷和单宁酸对脂肪体微粒体P450未表现出诱导作用,对中肠微粒体P450有一定的抑制作用,并导致棉铃虫对溴氰菊酯的敏感性增加.对CHAPS、Lubrol PX、Emulgen 911和胆酸钠四种去垢剂的比较研究发现:CHAPS对中肠和脂肪体微粒体P450的增溶效率最高,Lubrol PX、Emulgen 911和胆酸钠较差.CHAPS增溶中肠和脂肪体微粒体P450的最适浓度分别为0.5％和0.5％或0.8％.在0.5％浓度下,四种去垢剂均未使中肠和脂肪体微粒体P450变性.PEG沉淀法被用于P450的初步纯化.当PEG的浓度为2％时,约30％的微粒体蛋白和10％的P450被沉淀;PEG为5％时,约55％的微粒体蛋白和20％的P450被沉淀;PEG为8％时,约78％的微粒体蛋白和30％的P450被沉淀;PEG为11％时,约85％的微粒体蛋白和70％的P450被沉淀.其中,8％CHAPS适合于微粒体P450的初步纯化.经PEG沉淀后,中肠微粒体P450纯度提高了2.1倍,回收率为72％;被沉淀出的蛋白主要集中在14.4-40kDa和66-97kDa范围内.该文建立了HPHIC(Phenyl-5PW)分离P450的优化条件:①检测波长为405nm;②流速0.5ml/min;③50min线性梯度洗脱,从100％HICA<,2>至100％HICB.在该条件下,中肠微粒体经HPHIC分离后,P450主要存在于馏分7(t<,R>=39′0″-44′0″)和馏分8(t<,R>=44′01″-49′0″)中;与微粒体相比,P450纯度提高3.04倍,回收率为55.3％.该文还建立了HPIEC(DEAE-5PW)分离P450的优化条件:①检测波长为405nm;②流速0.5ml/min;③40min线性梯度洗脱,从100％IECA<,2>至100％IECB<,2>.在该条件下,馏分7和馏分8中的P450均在t<,R>=5-7min范围内洗脱出来;与微粒体比,P450纯度提高6.3倍,回收率为17.3％.SDS-PAGE(银染)显示:经HPIEC分离后,馏分7得到分子量为59±1.0kDa和48±1.9kDa的两条蛋白带;馏分8得到分子量为55±0.2kDa和46±1.9kDa的两条蛋白带.
棉铃虫;细胞色素P450;增溶;初步纯化;高效液相色谱
中国农业大学
博士
农药学
张文吉;邱星辉
2003
中文
S435.622.3
63
2004-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）