鸡传染性法氏囊病病毒非编码区结构和5′非编码区缺失病毒突变体构建及其诱导细胞凋亡的研究
为了研究超强毒株毒力增强的原因是否与非编码区有关,在基因特异性的上游引物引入T7 RNA聚合酶启动子序列和EcoRI酶切位点,下游引物引入XbaI（A节段）和BamHI(B节段）酶切位点,采用双融合PCR方法将超强毒株的非编码区和编码区正确拼接,并分别克隆到pUC18质粒的相应位点上.通过酶切和末端序列分析鉴定重组质粒,获得了全基因组cDNA克隆pUC18-HA和pUC18-HB,并以此为基础构建了3个A节段5′非编码区缺失的突变体pUC18-HAΔ35、pUC18-HAΔ74、pUC18-HAΔ94和1个嵌合体pUC18-C5′/HA的侵染性克隆.为进一步通过反转录遗传体系来研究5′非编码区对病毒复制和细胞凋亡的影响奠定了基础.将超强毒株Harbin-1A节段及其5′非编码区缺失突变体和嵌合体cDNA克隆用XbaI线性化,B节段cDNA克隆用SmaI线性化,进行体外转录,分别获得了各自的cRNA.A节段及其5′非编码区缺失突变体和嵌合体的cDNA分别与B节段cDNA共转染法氏囊原代细胞和Vero细胞,2天后收毒.转染上清经4次传代,用免疫荧光法检测病毒抗原,结果在法氏囊原代细胞上检测到了重组病毒（rIBDV）,而在Vero细胞上未能检测到病毒抗原.以重组病毒为材料进行病毒诱导细胞凋亡的研究,以荧光染色和流式细胞仪检测,发现重组病毒均能诱导法氏囊原代细胞发生凋亡,但不同的病毒诱导细胞凋亡的能力不同.5′非编码区缺失病毒诱导的细胞凋亡率明显低于野生型病毒,5′NCR的突变可能是影响RNA的稳定性、RNA的复制和病毒蛋白表达的速度,从而影响其诱导细胞凋亡的能力.该实验结果显示,IBDV的非编码区不是病毒复制所必需的.此研究为重组IBDV疫苗的研究提供理论依据.
法氏囊病病毒;RACE;双融合PCR;体外转录;反转录遗传体系;细胞凋亡;鸡
中国农业大学
博士
生物化学与分子生物学
张曼夫
2002
中文
S858.31
91
2004-04-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）