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摘要
英文摘要
1引言
1．1SARS-CoV-2抗病毒药物研究进展
1．2靶向SARS-CoV-2病毒的非结构蛋白的小分子药物研究
1．2．1 nsp5／Mpro／3CL
1．2．2 nsp12，nsp7和asp8
1．2．3 nsp3
1．3小结
1．4本课题研究内容和意义
2．1．1菌株，毒株和细胞株
2．1．2所用质粒
2．1．3所用引物
2．1．4G4-RNA序列及来源
2．1．5常用试剂和溶液及配置方式
2．2方法
2．2．1载体构建
2．2．2蓝白斑筛选
2．2．3重组Baemid的获得
2．2．4蛋白表达
2．2．5SUD-core蛋白序列分析
2．2．6SUD-core蛋白质纯化
2．2．7SARS-CoV-2 PLpro质粒构建及蛋白表达纯化
2．2．8人源Paip1M蛋白表达与纯化
2．2．9晶体制备
2．2．10晶体结构的解析
2．2．11目的蛋白的蛋白原位酶解试验
2．2．12目的蛋白的甲基化处理
2．2．13SARS-CoV-2 PLpro酶活检测及抑制剂筛选体系的建立
2．2．14圆二色光谱(CD spectra)
2．2．15凝胶迁移(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)
2．2．16生物层干涉技术(Bio-Layer Interferometry，BLI)
2．2．17MTT比色法
2．2．18病毒RNA的提取
2．2．19RT-qPCR
2．2．20感染性克隆构建
2．2．21噬斑试验
2．2．22热漂移实验(Thermal shift，TM)
2．2．23药物抗病毒检测
2．2．24药物代谢试验
3结果
3．1SARS-CoV-2PLpro蛋白表达及酶活测定
3．2GRL0617成药性评价
3．2．1GRL0617细胞外蛋白酶活抑制
3．2．2GRL0617细胞毒性检测
3．2．3GRL0617抗病毒能力检测
3．2．4GRL0617药代动力学检测
3．3针对GRL0617的药物改造和抑制剂筛选
3．4候选小分子药物的细胞毒性检测
3．5候选小分子药物的抗病毒能力检测
3．6PLpro与候选小分子化合物的复合物晶体
3．7SARS-CoV-2 S UD-core蛋白的序列分析
3．8SARS-CoV-2 S UD-core蛋白的表达与纯化
3．8．1表达条件筛选
3．8．2蛋白表达
3．9SARS-CoV-2 SUD-core蛋白原位酶解
3．10SARS-CoV-2 SUD-core蛋白甲基化
3．11SARS-CoV-2 SUD-core突变体蛋白的制备与结晶实验
3．12SARS-CoV-2 SUD-core Deletion蛋白的制备与结晶实验
3．13Sabecovirus SUD-core二硫键(C516-C647)的重要性
3．14 SARS-CoV-2 SUD-core CC蛋白的制备与结晶实验
3．14．1 SARS-CoV-2 SUD-core CC蛋白的制备
3．14．2蛋白质晶体优化
3．14．3蛋白质晶体数据收集和结构解析
3．15 SARS-CoV-2 SUD-core CC结构及分析
3．15．1 SARS-CoV-2 SUD-core CC的结构特征
3．15．2 SARS-CoV-2 SUD-core 与SARS-CoV SUD-core结构比对
3．16 SARS-CoV SUD-core与SARS-CoV-2 SUD-core功能的异同
3．16．1热稳定性比对
3．16．2与Paip1M的相互作用比对
3．16．3与G4的相互作用比对
3．17靶向SARS-CoV-2 SUD-core的药物筛选
3．17．1小分子抑制剂库筛选
3．17．2小分子抑制剂体外活性验证
3．17．3小分子化合物抗病毒能力测定
4讨论
4．2 SARS-CoV-2 SUD-core与SARS-CoV SUD-core的异同
4．3靶向SARS-CoV-2 SUD-core抗病毒药物研究
4．4总结及展望
参考文献
致谢
个人简历及发表文章