金黄色葡萄球菌一氧化氮合成酶NOS调控万古霉素耐药性发生的分子机制
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人类主要致病细菌，由甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus,MRSA)引发的感染正严重威胁公共健康安全。万古霉素被认为是临床上治疗严重MRSA感染的最后一道防线，但是，其中度耐药性金黄色葡萄球菌(vancomycin-intermediate S.aureus,VISA)的频繁出现，为MRSA的感染治疗带来了巨大挑战。因此，深入解析金黄色葡萄球菌万古霉素耐药机制具有重要的临床意义。一氧化氮(nitric oxide,NO)可作为信号分子，首先在真核生物中被发现可由一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)内源产生，参与调节各种生理及免疫功能。NO被报道能对蛋白质半胱氨酸残基的巯基进行S-亚硝基化修饰，进而影响蛋白质的活性和功能。金黄色葡萄球菌中也被证实存在可以催化产生NO的NOS,该酶被报道参与调控金黄色葡萄球菌的万古霉素耐药性，但相关分子机制尚不明确。基于此，本研究针对NOS如何调控万古霉素耐药性发生的分子机制这一关键科学问题展开了研究。 我选取临床VISA菌株XN108为研究对象。首先构建了NOS的敲除菌株，结果显示，nos突变菌株不仅对万古霉素等细胞壁靶向抗生素的抗性显著下降，其细胞壁厚度也显著下降，而且细胞自溶活性增加。通过添加NOS抑制剂发现，NOS抑制剂可使野生型VISA菌株XN108和Mu50中对万古霉素的抵抗能力显著下降。以上结果证实了金黄色葡萄球菌NOS在万古霉素等细胞壁靶向抗生素抗性发生过程中的重要作用。接下来，我利用蛋白质修饰组学的方法鉴定了金黄色葡萄球菌中可被内源NO亚硝基化修饰的靶标蛋白及相应位点，发现发生S-亚硝基化修饰的蛋白几乎涉及了细菌生命活动的各个领域。一个与抗生素抗性具有重要关联的转录因子MgrA上第12位的半胱氨酸发生了S-亚硝基化修饰，因此通过将半胱氨酸替换为不能被修饰的丝氨酸构建了mgrAC12S点突变菌株。结果显示，mgrAC12S突变菌株对万古霉素的抗性显著下降，与nos突变菌株类似。在万古霉素压力下，外源添加低浓度的NO供体对nos突变菌株生长有一定的回补作用，而在mgrAC12S突变菌株中，由于MgrA失去了发生S-亚硝基化修饰的能力，导致其感知NO信号的能力受损，生长被外源NO进一步抑制。mgrAC12S突变菌株细胞壁厚度显著下降、细胞自溶活性增加，但是，该突变菌株中细胞壁合成相关基因的转录水平并无显著变化，而lytN和sarV等自溶相关基因的转录水平显著上升，表明mgrAC12S突变菌株细胞壁厚度以及细胞自溶活性的变化主要由细胞壁降解途径而非合成途径的改变引起。此外，MgrA可通过S-亚硝基化修饰响应NO刺激信号并调控下游基因的转录;当MgrA失去S-亚硝基化修饰时，这种响应NO信号的能力遭到破坏。最后，通过凝胶阻滞迁移实验和染色质免疫共沉淀实验，分别从体外和体内揭示了金黄色葡萄球菌NOS及其内源产生的NO在促进万古霉素抗性中的作用机制:NOS来源的NO通过介导MgrA发生S-亚硝基化修饰，促进MgrA对自溶相关靶基因的负调控功能，导致细胞的自溶活性下降，介导细胞壁厚度增加，进而促进金黄色葡萄球菌的万古霉素耐药性。这种由NO介导的调控机制在另一个被鉴定到可发生S-亚硝基化修饰的转录因子WalR中得到了进一步的验证，表明金黄色葡萄球菌NOS内源产生的NO通过S-亚硝基化修饰介导的转录调控机制在细菌中可能具有普遍性。 综上所述，本研究证实了金黄色葡萄球菌NOS在万古霉素等细胞壁靶向抗生素抗性发生过程中扮演的重要角色，揭示了细菌NOS及其内源产生的NO通过介导靶蛋白的S-亚硝基化修饰以调控万古霉素耐药性发生的具体分子机制，有望为临床治疗VISA及其他细菌病原体的感染提供新的思路与策略。
金黄色葡萄球菌;一氧化氮合成酶;万古霉素;耐药性;分子机制
中国科学技术大学
博士
微生物学
孙宝林
2022
中文
R378.11
2023-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）