Trichokonins在长枝木霉SMF2--水稻白叶枯病菌互作中的功能研究
木霉属真菌(Trichodermaspp.)是一类广泛存在于土壤、水体以及植物的根表和叶表的丝状真菌。木霉能通过生境竞争作用、重寄生作用和抗生作用，有效抑制土传植物病原菌的生长而间接发挥其对植物的有益作用;也能诱导植物系统抗性的产生和促进植物生长而直接发挥其对植物的有益作用。因此，木霉属真菌成为近年来生物农药和生物肥料生产的重要功能菌株。木霉能够产生多种次级代谢产物参与木霉-病原菌、木霉-植物的相互作用。其中，非常重要的一类是由非核糖体肽合成酶(NonRibosomalPeptideSynthetase,NRPS)合成的富含α-氨基异丁酸的肽类次级代谢产物—peptaibols。研究发现，peptaibols具有广谱的抗革兰氏阳性细菌、抗植物病原真菌、抗病毒、抗线虫和诱导植物抗性等生物学功能，但目前尚无peptaibols有效拮抗革兰氏阴性细菌的报道。实验室在前期工作中，筛选到一株高产peptaibols的长枝木霉SMF2(TrichodermalongibrachiatumSMF2,TlSMF2)。其产生peptaibols有两类，一类是含有20个氨基酸残基的TrichokoninsA(其组分为TrichokoninⅥ、TrichokoninⅦ和TrichokoninⅧ),另一类是含有11个氨基酸残基的TrichokoninsB(其组分为TrichokoninB1-B6),分别由NRPS基因tlx1与tlx2负责合成。生物学活性研究发现，Trichokonins不仅有抗病毒、诱导植物抗性等活性，而且能够有效抑制革兰氏阳性细菌和病原真菌的生长，但是对大肠杆菌、大白菜软腐病菌等革兰氏阴性细菌拮抗作用不显著。 我们在研究水稻病害的生物防治中初步发现，TlSMF2具有一定的抑制革兰氏阴性病原细菌水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo)生长的作用。水稻白叶枯病是水稻生产中危害最大的细菌性病害之一，严重影响水稻产量，威胁粮食安全。目前该病害的防治主要以化学防治为主，严重影响环境和食品安全，绿色环保的生物防治成为重要的替代措施之一。因此，本论文拟系统研究了TlSMF2在与Xoo的互作过程中的功能。 TlSMF2与Xoo共培养实验发现，TlSMF2能够抑制Xoo的生长，菌落边缘形成明显的抑菌圈。次级代谢产物的抗菌活性分析发现，TlSMF2次级代谢产物对Xoo具有很好的抑制作用。采用TlSMF2野生型和TrichokoninsA合成酶基因缺失突变株Δtlx1,TrichokoninsB合成酶基因缺失突变株Δtlx2及TrichokoninsA、TrichokoninsB合成酶基因缺失突变株Δtlx1&tlx2研究不同突变株对Xoo的抑制作用。研究发现，与野生型TlSMF2相比，突变株Δtlx1与Δtlx1&tlx2及次级代谢产物对Xoo的抑制作用均显著降低，但Δtlx2对Xoo的抑制作用差异并不显著，说明TrichokoninsA是TlSMF2抑制Xoo生长的主要作用因子。进一步分离纯化了TrichokoninsA及其三种组分，研究TrichokoninsA对Xoo的抑制效果及其作用机制。研究发现，TrichokoninsA及其三个组分对Xoo都具有显著的抑制作用，TrichokoninsA的最小抑菌浓度为54μg/ml,TrichokoninⅥ的抑菌作用最强，最小抑菌浓度为38μg/ml。透射电子显微镜与原子力显微镜的观察发现，TrichokoninsA处理过的Xoo表面凹陷，出现褶皱，细菌膜局部出现破损。进一步分析发现TrichokoninsA处理造成GFP-Xoo内GFP的外流，处理后上清液的紫外吸收物质分析发现，TrichokoninsA处理引起Xoo胞内的核酸与蛋白质释放到胞外。Xoo致病相关基因的转录水平分析发现，0.25xMIC的TrichokoninsA处理，显著抑制Xoo中flhB、flhC等鞭毛合成基因和hrcC、hrcJ等Ⅲ型分泌系统基因的转录水平。27μg/mlTrichokoninsA处理的Xoo,显著降低其对水稻IR24的致病性。 同时，对TlSMF2基因组中与病原菌互作相关基因进行分析与挖掘，发现TlSMF2基因组含PKS型次级代谢产物基因13个，NRPS型基因9个，合成萜类基因4个，可能产生的次级代谢产物有SqualestatinS1、trichodiene、viriditoxin、YWA1、alternariol、choline和IlicicolinH等。对NRPS相关基因进行进化分析，推测TLX2在第5模块出现模块跳跃(moduleskipping)。TlSMF2基因组中还预测到TlSMF2胞外分泌蛋白中含有11个GH16家族葡聚糖水解酶，16个GH18家族几丁质酶，16个A01A家族蛋白酶和18个S08A家族蛋白酶等。 综上所述，peptaibols类次级代谢产物TrichokoninsA,在TlSMF2-Xoo相互作用中发挥重要作用，TrichokoninsA能够显著抑制Xoo的生长，影响细胞膜的透性，造成细胞内容物的外泄而造成菌体的死亡。同时TrichokoninsA影响Xoo的致病性，从而控制水稻白叶枯病害的发生。基因组预测分析发现TlSMF2有大量次级代谢产物编码基因和细胞壁降解酶基因，可能参与TlSMF2-Xoo相互作用。研究结果为木霉-Xoo相互作用机制的深入研究奠定了基础，为应用TlSMF2及其Trichokonins在水稻白叶枯病害的生物防治中的应用提供理论依据。
水稻白叶枯病菌;长枝木霉SMF2;Trichokonins;peptaibols;抑菌作用
山东大学
硕士
微生物学
宋晓妍;张玉忠
2023
中文
S435.111.47;S476.1
2023-10-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）