超大聚酮合酶翻译影响多杀菌素合成效率的研究
随着生命科学的发展，生物农药在农业中的研究颇为重要，其凭借安全性高、污染性低等优势推动着农业的可持续发展。多杀菌素是由刺糖多孢菌次级代谢产生(Saccharopolysporaspinosa)的天然产物，是一类安全、高效的绿色生物农药，具有独特的杀虫机理，已广泛应用于人类的生产生活中。我国由于生产技术的欠缺使得对于该农药的研究相比于美国陶氏益农公司处于落后状态，急需自主研发多杀菌素高产技术，本课题组利用自主开发的ExoCET直接克隆和多片段组装技术于2019年构建了人工多杀菌素重构基因簇，将其生物合成基因置于7个强启动子下，成功在白色链霉菌J1074中异源表达且产量达到了1.12mg/L,但此水平距离工业化生产所需还存在很大差距。 多杀菌素是一种典型的聚酮类化合物，其聚酮合酶结构复杂，是一类多结构域的酶或酶复合物。其聚酮合酶基因由spnA-E编码，长度分别高达6-17kb不等。细菌在转录过程中会发生提早终止转录或mRNA被降解的情况，导致不完整的mRNA产生。由于原核生物“边转录边翻译”的特点，这些截断mRNA也会被翻译，不可避免地产生非功能性多肽，造成细胞资源的浪费，增加生物体的代谢负担。2014年尹鹏团队开发了一种能够灵敏调控基因表达的立足开关系统(ToeholdSwitch),该系统包含SwitchRNA和TriggerRNA,通过二者在特定区域的配对启动RBS进行翻译。SangWooSeo团队在ToeholdSwitch系统的基础上设计了一种改善原核生物合成蛋白质量的控制系统——Proteinqualitycontrolsystem(ProQC系统)，该系统只有在完整的mRNA被转录的情况下才能进行翻译，截断的mRNA不能成为翻译的模板，以此提高蛋白表达的效率，该研究使得细菌全长蛋白的合成提高了2.5倍。超大聚酮合酶可能会产生更多的截断mRNA,通过构建ProQC系统可能会提高全长蛋白的比例，进而提高有效蛋白的合成效率。 本研究对多杀菌素聚酮合酶基因中最大的16767bp的spnE基因在链霉菌J1074中表达的转录水平进行分析，结果表明从5''端至3''端的转录水平逐渐降低，基因越长，产生截断mRNA的可能性就越大，表达全长mRNA的水平就越低。多杀菌素聚酮合酶基因属于超大型基因，产生较多不完整的mRNA导致无用蛋白的合成，有可能会降低多杀菌素生物合成效率。本研究计划构建聚酮合酶合成蛋白质量控制系统调控多杀菌素聚酮合酶基因，选择性翻译全长mRNA,提高全长蛋白的数量，以期提高多杀菌素的产量。本研究将ProQC系统应用于多杀菌素生物合成基因簇中，先后调控基因spnE及其聚酮合酶模块8、9和spnD,并在S.albusJ1074、S.coelicolorCH999中异源表达。实验首先利用ProQC系统调控绿色荧光蛋白基因mNeonGreen表达验证该系统能够成功应用于链霉菌中，进而利用自主基因编辑技术通过该系统调控spnE，使S.albusJ1074中的多杀菌素产量提高了2.4倍，S.coelicolorCH999中的产量提高13.8倍;该系统在调控spnE的基础上继续分别调控spnE中的延伸模块8、8和9,发现多杀菌素产量均得到提高，这说明单独的模块也能参与多杀菌素的合成，这可能与聚酮合酶复合体的结构有关;通过该系统继续调控spnD，多杀菌素产量并无显著提高，可能的原因是调控spnD和spnE的相同ProQC元件间发生了相互干扰，因此需要开发更多不同的ProQC元件来同时调控多个聚酮合酶表达。 多杀菌素高效生物合成是一大难题,在本研究中通过ProQC系统调控多杀菌素聚酮合酶基因，成功提高了多杀菌素产量。这种蛋白质量控制系统为实现天然产物高效生物合成提供了一种新的技术手段，对于更多天然产物生物合成途径的研究具有重要意义。
聚酮合酶;多杀菌素;ProQC系统;多片段组装;spnA-E编码
山东大学
硕士
微生物学
王海龙
2023
中文
Q946.887
2023-10-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）