艾地骨化醇通过调控Notch1/Wnt--β--catenin信号通路预防糖皮质激素性骨质疏松症
背景 糖皮质激素被广泛用于慢性非感染性疾病、过敏性疾病及器官移植等领域，在炎症反应、病毒感染、休克及免疫抑制等领域发挥药理学效应。然而，大剂量、长期应用糖皮质激素会导致严重的副作用，包括骨量的减少和骨微结构的破坏，进而引起糖皮质激素性骨质疏松症(Glucocorticoid-inducedosteoporosis,GIOP)。近年来，GIOP的发病率逐年攀升，严重影响患者的生活质量，GIOP无疑已经成为了临床上亟待解决的难题。作为最常见的继发性骨质疏松症，GIOP的病理特点为骨量减少、骨密度降低、骨脆性增加、骨折风险升高以及骨组织结构受损。30％的患者在服用糖皮质激素后出现GIOP,并且相较于原发性骨质疏松症，GIOP在病程早期即可引发骨折，预后较差，鉴于GIOP发病的可预见性,GIOP的预防药物非常具有研究前景。艾地骨化醇(Eldecalcitol,ED-71)是抗骨质疏松症一线药物，近期在我国上市，是新型活性维生素D类似物，已有众多研究报道了ED-71在治疗绝经后骨质疏松症方面的疗效，但其在预防GIOP方面的作用有待于进一步证实。本研究旨在明确ED-71预防GIOP的作用及相关机制。预期成果将为临床预防GIOP提供新的理论基础，具有积极的科学意义。 材料和方法 1、评价ED-71对糖皮质激素性骨质疏松症的预防效果 以7周龄雄性C57BL/6小鼠作为研究对象，分别使用中效糖皮质激素甲基强的松(Methylprednisolone,MPED)和长效糖皮质激素地塞米松(Dexamethasone,DEX)构建小鼠GIOP模型，并随机分为三组:1)对照组;2)糖皮质激素组，腹腔注射MPED10mg/kg/天，持续4周，或DEX1mg/kg/天，持续8周，生理盐水作为对照;3)ED-71组，腹腔注射MPED10mg/kg/天，或DEX1mg/kg/天，以50ng/kg/天的剂量经口同期投给ED-71,以达到预防性投药的效果，其余对照组进行中链甘油三酯灌胃。给药4或8周后，取小鼠股骨。通过微计算机断层扫描技术(Micro-CT)和苏木精-伊红(Haematoxylin-eosin,HE)染色评价骨组织形态学;钙黄绿素-四环素标记检测新骨形成速率。 2、阐明ED-71对糖皮质激素作用下成骨分化的影响 采用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色检测C57BL/6小鼠体内成骨分化相关因子的表达情况。使用DEX和ED-71处理前成骨细胞系MC3T3-E1细胞，通过加入矿化诱导液进行成骨诱导。通过碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)染色评估MC3T3-E1细胞的成骨分化能力;通过茜素红(Alizarinred,AR)染色评估MC3T3-E1细胞的成骨矿化能力;通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-timequantitativepolymerasechainreaction,qRT-PCR)和免疫印迹反应(Westernblot),进行成骨分化相关因子表达的检测。 3、探究糖皮质激素作用下ED-71调控成骨分化的作用机制 体外培养MC3T3-E1细胞，给予DEX或/和ED-71刺激,通过细胞免疫荧光、qRT-PCR和Westernblot检测Notch1和Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路相关因子的表达情况。分别对MC3T3-E1细胞给予Wnt信号抑制剂(XAV939)或激活Notch1信号通路，并给予DEX或/和ED-71刺激，通过qRT-PCR和Westernblot检测Notch1信号、Wnt/β-catenin信号通路相关因子的表达，以及成骨相关因子的变化;通过ALP染色和AR染色分别评估MC3T3-E1细胞的成骨分化及矿化能力。 结果 1、ED-71能够预防GIOP小鼠的骨量丢失，促进骨形成和抑制骨吸收 投给糖皮质激素的C57BL/6小鼠股骨的松质骨骨量较对照组显著降低,骨小梁排列稀疏，数目减少，厚度变薄，分离度增加，且新骨形成速率减慢;预防性投给ED-71后,GIOP小鼠的骨质疏松发病进程有所延缓，一定程度上预防了糖皮质激素引起的骨量丢失。此外，糖皮质激素的使用不仅减少了ALP阳性成骨细胞，也减少抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP)阳性破骨细胞，而ED-71增加了ALP阳性成骨细胞，同时进一步减少了TRAP阳性破骨细胞。 2、ED-71改善糖皮质激素对成骨细胞分化的抑制作用 与对照组相比，GIOP组小鼠股骨组织中成骨分化相关因子，包括:Runt相关转录因子2(Runt-relatedtranscriptionfactor2,RUNX2)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)及I型胶原(Collagentype1,COL1)的表达显著减少，预防性投给ED-71后，RUNX2、OCN及COL1的表达水平有所恢复。体外实验显示，在进行成骨分化诱导后，ED-71增强了ALP阳性表达，AR染色显示矿化结节增加，同时，ED-71促进了MC3T3-E1细胞ALP、RUNX2、OCN及COL1的表达。 3、Notch1/Wnt-β-catenin信号通路介导了ED-71调节GIOP状态下的成骨细胞分化 与糖皮质激素组相比，投给ED-71增加了MC3T3-E1细胞的Notch1水平，以及Wnt通路相关因子Wnt5a、卷曲蛋白4(Frizzled4，FZD4)和磷酸化的糖原合成酶激酶3β(GSK3-β-p),其下游的β-catenin以及活化的β-catenin(Active-β-catenin)表达水平也显著升高。在DEX+ED-71组中可以观察到，加入Wnt信号抑制剂XAV939后，β-catenin以及成骨分化相关因子ALP、COL1、RUNX2、OCN的mRNA表达下降，Wnt-β-catenin通路相关因子Wnt5a、FZD4、β-catenin、Active-β-catenin及上述成骨分化相关蛋白表达降低，同时，ALP染色显示阳性表达区域减少，AR染色显示矿化结节减少。在DEX+ED-71组可以观察到，激活Notch1信号通路后，Hes1、β-catenin以及成骨分化相关因子ALP、COL1、RUNX2、OCN的mRNA表达下降，β-catenin、RUNX2、OCN的蛋白表达下降，同时，ALP染色阳性表达减少，AR染色显示矿化结节减少。 结论 1、ED-71通过促进骨形成和抑制骨吸收的方式预防GIOP小鼠的骨量丢失。 2、ED-71可以改善糖皮质激素对成骨细胞分化的抑制作用。 3、ED-71通过Notch1/Wnt-β-catenin信号通路影响糖皮质激素环境下的成骨细胞分化。
骨质疏松症;糖皮质激素;艾地骨化醇;成骨分化;Notch1信号
山东大学
硕士
口腔基础医学
李敏启
2023
中文
R681.1
2023-10-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）