古菌DNA损伤应答核心调控因子Orc1--2的磷酸化及多层次功能调控研究
细菌、真核生物和古菌都不断面临着遗传物质损伤的威胁，为此，他们进化出一个复杂的信号转导网络，称为DNA损伤应答(DNAdamageresponse,DDR),通过协调DNA损伤修复、损伤耐受、抑制DNA复制和细胞周期停滞等一系列细胞事件来维持基因组完整性。有缺陷的DDR过程将造成人类等高等真核生物的免疫缺陷、神经退化、过早衰老和癌症等严重疾病，并导致原核生物基因突变或细胞死亡，因此，需要对DDR进行严格的时空调控。现有的研究表明，细菌、真核生物和古菌各自拥有独特的DDR调控因子:细菌主要利用LexA(细菌SOS应答全局性转录调控因子)的蛋白水解来释放大量参与细胞周期阻滞和DNA修复基因的表达;真核生物通过三种激酶(DNA-PK、ATM和ATR)介导的级联磷酸化触发对不同类型DNA损伤的全局反应;对于古菌而言，已经证明，Orc1/Cdc6家族蛋白Orc1-2在DDR调控中发挥核心作用，然而相关机制仍不清楚。本文以古菌DDR核心调控因子Orc1-2为切入点，从蛋白翻译后修饰和保守结构域两个角度研究古菌DDR调控的分子机制。 可逆蛋白磷酸化是真核生物DNA损伤信号转导的主要机制，在古菌中也已经被发现参与细胞运动、蛋白质转录和翻译等多种生命活动的调节。对古菌Orc1蛋白的生化特性和磷酸化蛋白组学研究表明，这类蛋白能够发生磷酸化修饰。为了确定Orc1-2是否在DDR调控过程中经历了磷酸化修饰，并阐释磷酸化对Orc1-2功能的影响，我们首先采取原位表达策略，在Sulfolobusislandicusorc1-2基因原位3''末端插入6×His-tag编码序列，成功构建突变株orc1-2His。随后从orc1-2His中分别纯化了DNA损伤处理前后的Orc1-2蛋白进行高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)鉴定，发现Orc1-2上存在一个未报道的，DNA损伤直接相关的差异磷酸化位点Thr356,该位点在未经处理的细胞中是磷酸化状态，DNA损伤处理后则是非磷酸化状态。接下来，我们利用基于内源CRISPR系统的基因编辑技术，在S.islandicus基因组上的orc1-2基因座引入点突变，分别构建了非磷酸化突变株orc1-2T356A和模拟磷酸化突变株orc1-2T356D。对两个突变株的遗传分析发现，orc1-2T356D对DNA损伤更加敏感，在NQO处理后不再表现出DDR反应，而orc1-2T356A产生了相反的效果，它对DNA损伤的耐受性增强，并且代表性DDR基因的DNA损伤诱导表达水平更高，DDR窗口延长，这表明Orc1-2Thr356位点磷酸化负向调控S.islandicusDDR。最后，我们通过体外DNA结合实验和体内蛋白亚定位分析评估了非磷酸化突变体Ore1-2T356A和模拟磷酸化突变体Orc1-2T356D的DNA结合活性，发现与野生型蛋白相比，Ore1-2T356D的DNA结合活性显著降低,而Orc1-2T356A与基因组DNA结合更紧密。综上所述，Orc1-2Thr356位点磷酸化通过影响其与DNA结合，对S.islandicusDDR进行负调控。 蛋白质磷酸化是由蛋白激酶(proteinkinases,PKs)催化的氨基酸的共价、可逆修饰。为了确定负责Ore1-2磷酸化的PKs,我们首先对S.islandicus中两个起主要调控作用的Ser/ThrPKsSiRe_2030和SiRe_2056的编码基因进行单敲除和双敲除，成功获得突变株Δsire_2030、Δsire_2056和Δsire_2030Δsire_2056。随后，对突变株进行遗传分析发现，SiRe_2030或SiRe_2056缺失后菌株的DNA损伤耐受性都会增强，但是Δsire_2056中关键DDR基因的表达模式更加类似于orc1-2T356A,这表明SiRe_2030和SiRe_2056可能通过不同信号通路负调控S.islandicusDDR,并且SiRe_2056更有可能通过调节Orc1-2磷酸化来实现对DDR的负调控作用。最后，我们从大肠杆菌中纯化Orc1-2及其突变体蛋白进行体外磷酸化分析，发现单独的Orc1-2不能发生自磷酸化，当SiRe_2030或SiRe_2056存在时，Orc1-2都能被磷酸化，但是SiRe_2056对Orc1-2的磷酸化活性显著高于SiRe_2030,说明Orc1-2是SiRe_2056的底物。HPLC-MS/MS鉴定结果表明，SiRe_2056能够催化Orc1-2多个位点磷酸化，然而其中并不包括Thr356。综上所述，SiRe_2056极有可能是Orc1-2上游PK,但催化机制有待进一步研究。 Orc1-2在结构上分为两部分，N端是典型的AAA+ATP酶结构域，C端是与DNA结合的wH结构域，ATP酶结构域中包含分别负责ATP结合和ATP水解的WalkerA和WalkerB基序，以及一个特别的起始蛋白特异元件(initiatorspecificmotif,ISM)。为了阐释Orc1-2各个功能域在S.islandicusDDR调控中的作用，我们首先根据已报道的古菌Orc1蛋白晶体结构及其氨基酸序列对S.islandicusOrc1-2进行蛋白结构模拟和多序列比对，发现ATP酶结构域和wH结构域中的关键氨基酸残基在古菌Orc1蛋白中都是保守的，包括ATP酶结构域中的K72(WalkerA)、E154(WalkerB)和G127/L128(ISM)以及wH结构域中的两对精氨酸残基R353/R354和R381/R383。随后，我们对orc1-2基因座中上述位点进行点突变，菌株构建过程中发现无法获得WalkerB(E154A)突变株，说明Orc1-2ATP水解活性丧失对S.islandicus细胞是致命的，然而其细胞毒性可以通过wH结构域突变解除，说明Orc1-2WalkerB突变体介导细胞死亡的过程依赖于DNA结合。用弱启动子ParaS-38驱动WalkerB突变体在S.islandicus中的表达，发现Orc1-2E154A无法激活硫化叶菌DDR但却能够在相对低浓度且没有任何DNA损伤信号的情况下介导细胞周期阻滞。对其余突变株的遗传分析结果表明，Orc1-2各个保守结构域都对硫化叶菌DDR起到必不可少的作用，任何一个功能域的破坏都能完全消除S.islandicus的DDR反应。最后，我们从大肠杆菌中纯化Orc1-2及其突变体蛋白，并在体外研究其与DNA的相互作用，发现Orc1-2AAA+ATP酶结构域和wH结构域都参与DNA结合，其中ISM和wH结构域中的R381/R383负责特异性DNA结合。综上所述，Orc1-2AAA+ATP酶结构域和wH结构域都在S.islandicusDDR调控中发挥重要作用，其中wH主要负责DNA结合，而ATP酶结构域不仅通过ATP结合和ATP水解形成分子开关，还能通过ISM基序调节Orc1-2对DNA的特异性识别。此外，通过调节蛋白浓度，Orc1-2可以激活至少两个层次的DDR,低浓度Orc1-2引发细胞周期阻滞,这种调节通过ATP结合打开，通过ATP水解关闭，关闭失败会导致生长抑制和细胞死亡，高浓度Orc1-2则激活DNA修复相关DDR基因的表达。
古菌;DNA损伤应答;核心调控因子;Orc1-2;可逆蛋白磷酸化;细胞周期阻滞
山东大学
博士
微生物学
佘群新
2023
中文
Q939.1
2023-10-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）