艾地骨化醇通过调控氧化应激改善绝经后骨质疏松症的机制研究
背景 绝经后骨质疏松症(postmenopausalosteoporosis,PMOP)是最常见的骨质疏松症类型，是由于绝经后雌激素分泌不足，导致女性的骨密度下降和骨折风险增加。随着人口老龄化的加剧,PMOP成为一个日益严重的社会问题。艾地骨化醇(Eldecalcitol,ED-71)是第三代活性维生素D类似物，具有半衰期长和副作用低等优点，能够通过抑制骨吸收和促进骨形成改善PMOP,但具体机制尚待阐明。氧化应激被认为是PMOP的元凶，而受到越来越多的关注。结合课题组前期发现ED-71在改善牙周炎症过程中具有抗氧化功能，推测ED-71对PMOP状态下氧化应激的抑制作用可能是其改善PMOP的重要途径。因此，本研究在明确ED-71改善PMOP骨量流失的基础上，深入探讨其通过抑制氧化应激调节骨形成和骨吸收的作用机制，以期为PMOP的临床用药提供理论基础。 材料和方法 1、ED-71改善去卵巢(ovariectomized,OVX)大鼠的骨质疏松状态 (1)评价ED-71对OVX大鼠骨量的影响 建立大鼠OVX模型以模拟绝经后骨质疏松症，经灌胃方式投给30ng/kg浓度的ED-71,每日1次，持续8周;每周定期记录大鼠的体重;通过Micro-CT、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和MASSON染色评价大鼠股骨的骨量、骨组织学参数和新骨形成状态。 (2)观察ED-71对成骨细胞和破骨细胞功能的影响 通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistantacidphosphatase,TRAP)染色和组织蛋白酶K(cathepsinK,CtsK)的免疫组织化学染色观察大鼠股骨区域的破骨细胞状态;通过碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)和I型胶原蛋白(collagenI,COLI)的免疫组织化学染色观察大鼠股骨区域的成骨细胞功能。 2、ED-71通过调控氧化应激改善PMOP (1)评价ED-71在改善PMOP过程中的抗氧化作用 提取大鼠骨组织和血清，通过骨组织实时荧光聚合酶链反应(real-timepolymerasechainreaction,qRT-PCR)、蛋白质印迹(WesternBlot)和血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测分析OVX大鼠的氧化应激水平;体外培养RAW264.7细胞系和大鼠骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCs),加入H2O2模拟骨质疏松症的氧化应激状态，通过DCFH-DA染色和qRT-PCR检测ED-71对BMSCs和RAW264.7细胞氧化应激状态的影响。 （2）观察ED-71对氧化应激状态下成骨分化和破骨分化的影响 通过ALP染色、WesternBlot、qRT-PCR和DCFH-DA染色检测假手术（Sham）组和OVX组大鼠BMSCs的成骨分化能力和氧化应激水平;通过茜素红染色和WesternBlot检测ED-71对OVX大鼠BMSCs成骨分化的影响;向RAW264.7细胞中加入过氧化氢（H2O2）以模拟骨质疏松症的氧化应激状态，通过TRAP染色、F-肌动蛋白环染色、WesternBlot和qRT-PCR检测ED-71对破骨细胞分化的影响。 3、ED-71通过调节氧化应激状态下BMSCs衰老促进骨形成的作用机制 （1）评价ED-71对OVX大鼠细胞衰老的影响 体内通过免疫组织化学染色观察大鼠股骨区域细胞衰老的情况;提取大鼠股骨组织的RNA和蛋白，通过组织qRT-PCR和WesternBlot评价不同组大鼠骨组织中衰老相关因子表达差异。 （2）观察ED-71对OVX大鼠BMSCs衰老的调节作用 提取并体外培养大鼠BMSCs,通过β-半乳糖苷酶（β-galactosidase,β-gal）染色、qRT-PCR、WesternBlot和细胞免疫荧光染色比较Sham组和OVX组BMSCs的细胞衰老情况，并观察ED-71对OVX大鼠BMSCs的细胞衰老的调节作用。 （3）阐明氧化应激状态下BMSCs衰老与成骨分化的联系 对大鼠BMSCs进行成骨分化诱导，通过WesternBlot检测成骨相关因子的表达情况，探究细胞衰老在ED-71促BMSCs成骨分化过程中的作用;使用H2O2调节细胞氧化应激状态，通过DCFH-DA染色和β-gal染色检测细胞ROS和衰老水平，探究ED-71是否通过抗氧化来调节细胞衰老。 （4）探究ED-71通过调节BMSCs衰老促进成骨分化的作用机制 通过qRT-PCR、WesternBlot和细胞免疫荧光染色检测SIRT1-Nrf2信号的表达变化;通过使用SIRT1抑制剂EX-527和Nrf2抑制剂ML-385进行信号通路的验证;通过WesternBlot、DCFH-DA染色和β-gal染色探究SIRT1-Nrf2信号是否参与了ED-71调节氧化应激、细胞衰老和成骨分化的过程。 4、ED-71通过调节氧化应激状态下EphrinB2-EphB4信号抑制骨吸收的作用机制 （1）观察ED-71对破骨细胞表达EphrinB2的影响 通过免疫组织化学染色观察ED-71对大鼠股骨区域EphrinB2表达的影响;体外建立模拟骨质疏松状态的H2O2刺激模型，并对RAW264.7细胞进行破骨分化诱导;通过qRT-PCR和WesternBlot检测破骨细胞EphrinB2表达情况;使用siRNA敲低破骨细胞中EphrinB2,通过TRAP染色、F-肌动蛋白环染色、qRT-PCR和WesternBlot检测破骨细胞分化情况。 (2)观察ED-71对成骨细胞EphB4的调节作用 通过免疫组织化学染色观察ED-71对大鼠股骨区域EphB4表达的影响;体外加入H2O2刺激MC3T3-E1细胞，并对其进行成骨诱导;通过qRT-PCR、WesternBlot和细胞免疫荧光染色检测成骨细胞EphB4的表达情况。 (3)共培养环境下验证ED-71通过调节EphrinB2-EphB4信号抑制破骨细胞分化 通过建立MC3T3-E1细胞与RAW264.7细胞共培养模型来模拟成骨细胞与破骨细胞之间的直接接触;使用EphB4抗体阻断成骨细胞的EphB4,以抑制EphrinB2-EphB4信号的激活;通过F-肌动蛋白环染色观察破骨细胞分化情况。 结果 1、ED-71改善PMOP的骨量流失，抑制骨吸收并促进骨形成 与Sham组比较，OVX组大鼠的骨量减少，体重明显增加，ED-71治疗后能够抑制OVX大鼠的骨量减少和体重增加，促进新骨形成。组织学染色结果显示，与Sham组相比，OVX组大鼠股骨中TRAP阳性和CtsK阳性破骨细胞明显增加，ALP阳性成骨细胞略增多，OCN的阳性表达升高，COLI沉积减少;ED-71显著降低OVX大鼠的TRAP阳性和CtsK阳性破骨细胞数量，抑制骨吸收，同时增加OCN和COLI的阳性表达，促进骨形成。HE染色观察到ED-71促进了OVX大鼠骨小梁区域的“迷你型塑造”骨形成。 2、ED-71通过调控氧化应激影响PMOP骨形成和骨吸收过程 与Sham组相比，OVX大鼠的血清和骨组织中氧化应激水平升高，ED-71对氧化应激具有抑制作用。体外研究发现ED-71逆转了H2O2诱导的BMSCs和RAW264.7细胞中ROS的增加。相比于Sham组，OVX组BMSCs的氧化应激水平增加，成骨分化能力降低，而ED-71可以改善OVX大鼠BMSCs的成骨分化能力。ED-71可以抑制H2O2诱导的破骨细胞分化。 3、ED-71通过SIRT1-Nrf2信号通路抑制氧化应激状态导致的BMSCs衰老促进骨形成 免疫组织化学染色结果显示，OVX组大鼠骨组织中衰老相关因子的表达增加，而ED-71的投给逆转了这些因子的变化。体外提取培养BMSCs后，发现OVX组BMSCs衰老比例高于Sham组，而ED-71能够显著改善OVX引起的BMSCs氧化应激和细胞衰老，促进OVX大鼠BMSCs的成骨分化能力。通过加入H2O2增强氧化应激后，逆转了ED-71对BMSCs衰老的抑制作用。ED-71能够增加OVX大鼠BMSCs中SIRT1和Nrf2的表达;抑制SIRT1或Nrf2后，ED-71对OVX大鼠BMSCs的氧化应激和细胞衰老的抑制作用，以及对成骨分化的促进作用都减弱。 4、ED-71通过激活氧化应激状态下EphB4-EphrinB2信号抑制骨吸收 在H2O2模拟的氧化应激状态下，ROS的累积抑制了破骨细胞EphrinB2和成骨细胞EphB4的表达，而ED-71在体内和体外均能够改善这一作用。敲低EphrinB2逆转了ED-71对H2O2诱导的破骨细胞分化的抑制。在成骨细胞与破骨细胞共培养体系中，ED-71能够显著抑制破骨细胞的分化，且这种抑制作用因阻断成骨细胞与破骨细胞间的EphB4-EphrinB2信号而减弱。 结论 1、ED-71改善OVX大鼠的体重增加和骨量减少，抑制破骨细胞并促进成骨细胞。 2、ED-71通过调控氧化应激改善PMOP。 3、ED-71通过增强SIRT1-Nrf2信号抑制OVX大鼠BMSCs的氧化应激，从而抑制细胞衰老，促进成骨细胞分化。 4、ED-71通过增强成骨细胞与破骨细胞间的EphB4-EphrinB2信号抑制氧化应激诱导的破骨细胞分化。
骨质疏松症;艾地骨化醇;氧化应激;骨髓间充质干细胞;EphB4-EphrinB2信号
山东大学
博士
口腔基础医学
李敏启
2023
中文
R681.1
2023-09-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）