细胞色素P450酶动态底物通道调控机制的研究
底物通道的性能是影响酶催化特性的关键因素之一。不同于以往基于静态结构的底物通道形貌分析，本文通过探究细胞色素P450中loop环对底物通道的动态影响，首次提出了一种loop工程策略以提高细胞色素P450通道的运输性能，增强底物通道的打开时间，并揭示了围绕在底物通道入口周围的loop环与底物通道之间的分子机制。 首先，本文基于对CYP116B3野生型、突变体70A08和突变体74H10的分子动力学模拟、底物通道分析和丙氨酸扫描实验，确定了围绕在CYP116B3底物通道入口周围的loop环(loop B-B'' 和loop B''-C)上的5个关键位点(A86,T91,M108,A109,T111),并对这5个位点进行同时饱和突变，建立多位点饱和突变库。经过对突变库的初筛和复筛，本文筛选到9个活性显著提高的突变体，其中最好的突变体8G8(A86T/T91L/M108N/A109M/T111A)相比 CYP116B3 野生型，对 7-乙氧基香豆素的催化效率kcat/Km提高了 134倍，偶联效率提高了约5倍。同时,变体8G8对多环芳烃的羟基化活性也有明显提升，其相比野生型对萘的羟基化活性提高了 9倍，对甲苯、苊和芴的催化活性至少提高了 2.5倍。 随后，本文将CYP116B3野生型和9个突变体进行了分子动力学模拟和动态通道分析，计算分析表明降低围绕在通道入口周围的loopB-B''和loopB''-C的灵活性有利于增加底物通道的打开时间，促进底物/产物的运输效率。总之，本文对围绕在通道入口周围的loop环的重新设计提供了一个有力且可能通用的loop工程策略以调控底物/产物的运输。
细胞色素P450酶;动态底物通道;运输性能;loop工程策略
北京化工大学
硕士
生物工程
刘珞
2023
中文
Q559.9
2023-09-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）