基于氢化酶再生辅因子的一碳还原途径的设计和构建
二氧化碳等C1化合物的生物固定是实现双碳目标的重要途径之一，而C1化合物的还原依赖于氧化还原当量NADH的外部电子供应，由于NADH昂贵，外源添加在经济上是不可行的。常规的酶再生法如葡萄糖脱氢酶再生NADH需要消耗葡萄糖，且会产生水溶性副产物葡萄糖酸，不够绿色和经济。而氢能是可再生能源，本课题引入耐氧的[NiFe]-氢化酶，该酶可利用氢气实现辅因子NADH的高效再生，为C1化合物的体外无细胞还原提供还原当量。 结合热力学计算，论文设计构建了将甲酸还原为二羟基丙酮(DHA)和甘油的热力学优势C1还原途径。在酶级联体系中，首先甲醛脱氢酶催化甲酸还原为甲醛，然后甲醛酶将三个甲醛分子缩合成一个DHA,最后甘油脱氢酶将DHA还原为甘油。氢化酶SH则利用氢气再生NADH,为体系提供还原当量。 为了实现将C1甲酸还原为DHA和甘油途径，首先采用“个体启动子”策略表达氢化酶，解决了多顺反子中基因表达量会随着目的基因与启动子的距离增加而降低的难题，成功表达了两个氢化酶变体(SH-PSH4、SH-PSH6)的结构基因和辅助基因。并用NADH法测得SH-PSH4、SH-PSH6比酶活分别为0.762 U·mg-1和0.281 U·mg-1。再通过氢化酶与甲醛脱氢酶偶联测试了这两个变体的NADH再生能力，发现SH-PSH6由于氧稳定性较差，1h后产物几乎不再积累，而SH-PSH4则具有较好的辅因子再生能力，反应3h后产物积累量达到了 SH-PSH6组的2.5倍。接下来，论文引入了改造后的甲醛酶(FLS-M3),该酶选择性地将中间产物甲醛缩合为DHA,反应2h后积累了 373.19μM4的DHA,底物转化率达到7.47％,热力学有效地拉动甲酸还原为DHA。最后，在SH稳定性有所改善的条件下，将甲醛脱氢酶、甲醛酶、甘油脱氢酶联用从甲酸合成甘油，SH同时为两个酶提供还原当量，实现了 44.63 μM的甘油积累。 由于多亚基氢化酶结构复杂且异源功能性表达困难，仅有少量将其用于精细化学品合成的报道。本论文验证了异源表达的氢化酶可以利用氢气为C1还原提供氧化还原当量，用于合成大宗化学品，绿色环保极具发展潜力。
碳1化合物;体外无细胞还原;[镍铁]-氢化酶;还原型辅酶Ⅰ
北京化工大学
硕士
轻工技术与工程
刘珞
2023
中文
TQ031.6
2023-09-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）