生物法合成己二酸关键酶的改造
己二酸是一种重要的有机二元羧酸，可以用于合成尼龙66以及聚氨酯，是非常重要的平台化合物。目前己二酸主要以石油为原料，以环己烯或者环己酮法进行化学合成，此过程需要浓硝酸进行催化，耗能高，并且产生大量的有毒有害气体(N2O),对环境造成严重威胁，并且由于石化能源的不可再生，该方法不可持续。因此需要寻找一种绿色可持续的方法来代替化学合成。目前，生物法合成己二酸已经取得了很多进展，其中己二酸的前体粘康酸的产量已经突破到了 85g/L,因此以粘康酸加氢还原生产己二酸的路线具有很大的前景。 来源于凝结芽孢杆菌(B.coagulans)的2-ER类烯酸还原酶ERBC具备催化粘康酸生成己二酸的功能，但是存在催化速率慢，转化率低等问题。本文将ERBC的基因重组于大肠杆菌中进行过表达，设计了一种厌氧条件下的全细胞催化方法应用于突变体的筛选。通过理性设计，对ERBC进行定点突变以及筛选，最终获得了两种改良突变体G27M和G27M/I374S。其中最佳突变体G27M/I374S对2-烯己二酸以及粘康酸为底物的细胞活性分别为8.58 mU/mg和2.75 mU/mg,是野生型(4.57mU/mg)的 1.87 倍和(0.19mU/mg)15.3 倍。以 20mM粘康酸为底物，突变体G27M/I374S反应24 h的己二酸产量为5.9 mM(0.87g/L),比野生型(0.5 mM,0.073 g/L)提高了 11.8 倍。 通过进一步对全细胞催化反应进行NADH,葡萄糖浓度，pH,底物浓度，菌体浓度等条件的探究及优化。最终以20 mM粘康酸为底物，G27M/I374S在反应8h生产了 13.5 mM(1.9 g/L)的己二酸，收率为67％,相比优化前(0.87 g/L)提高了 2.27倍。
己二酸;生物法;烯酸还原酶;凝结芽孢杆菌;基因重组;大肠杆菌;突变体筛选;全细胞催化反应
北京化工大学
硕士
化学工程与技术
谭天伟
2023
中文
TQ225.146
2023-09-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）