以葡萄糖为碳源发酵产木糖醇
木糖醇(xylitol)广泛存在于自然界的果蔬中，常应用于食品、医药等行业。目前木糖醇主要通过化学方法合成，但是该方法存在反应条件苛刻、污染严重等问题，通过生物法合成的木糖醇均以成本较高的木糖为原料，因此，在大肠杆菌中设计一条以葡萄糖为碳源生产木糖醇的绿色合成途径有着十分重要的意义。本研究通过筛选合成途径的关键酶，构建了从头合成木糖醇的大肠杆菌工程菌株，具体研究成果如下: 首先，在大肠杆菌磷酸戊糖途径的基础上设计了木糖醇的合成途径，并引入来自博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的木糖还原酶XR,实现了添加底物木糖在大肠杆菌中生物合成木糖醇。随后敲除了编码葡萄糖-6-磷酸异构酶、核糖-5-磷酸异构酶以及木酮糖激酶的基因pgi、rpiA、rpiB以及xylB,阻断了代谢网络中的竞争路径，得到大肠杆菌工程菌(BW25113 4Δ),并筛选到来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的糖磷酸酶araL、来自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica CLIB122)的YALI0E28919p酶和来自萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)的araL1酶，基于质粒表达系统在BW25113 4Δ菌株中成功表达，实现了在大肠杆菌中以葡萄糖为碳源从头合成木糖醇，其产量分别为95 mg/L、72mg/L和118mg/L。对最优产量酶的合成途径进行上游内源基因过表达后，提高了流向目标产物的碳通量，产量提高了 16％,达到137mg/L。因发酵样品呈酸性，考虑到外源酶的最适pH值，在调节了菌株生长环境的pH之后，木糖醇产量达到209mg/L。最后，对关键糖磷酸酶进行同源建模和分子对接，得到关键催化位点后进行定点饱和突变，建立了一种新型的糖磷酸酶筛选方法，成功筛选出酶的有益突变应用于木糖醇的生产，最终的工程菌株木糖醇总产量为370mg/L,与初始菌株相比提高了产量提高了 214％。 本研究在大肠杆菌基因组水平上应用了代谢工程策略及分子生物学手段，提高了从头合成木糖醇的产量，该菌株生长和生产性能良好，对实现木糖醇的大规模生物合成奠定了基础。
木糖醇;发酵工艺;葡萄糖;大肠杆菌
北京化工大学
硕士
生物与医药
孙新晓;刘树蓬
2023
中文
TQ923
2023-09-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）