产衣康酸的菌种选育及关键酶的影响分析
衣康酸是一种不饱和二元有机羧酸，是12种平台化合物之一，其化学性质活泼，在化工、材料、医疗等领域具有广泛用途。衣康酸主要通过丝状真菌土曲霉的发酵来生产，高产菌种的选育以及利用基因工程对菌种进行改造是提高衣康酸产量的重要方法，但目前对土曲霉菌种的高通量筛选方法以及影响其合成衣康酸的关键基因研究较少。因此,针对上述问题,本论文构建了土曲霉菌种的高通量筛选方法，并通过基因转录水平分析,明确了影响土曲霉合成衣康酸的关键基因。具体的研究内容及取得的成果如下: 首先，基于碘苯与衣康酸之间发生的Mizoroki-Heck偶联反应建立了一个特异性强、便捷高效的高通量筛选方法。采用木糖压力筛选、紫外-氯化锂复合诱变及硫酸二乙酯诱变方法对Aspergillus terreus CICC 40205-2-67进行诱变处理，利用Mizoroki-Heck显色反应及酶标仪检测分析，从诱变菌种筛选得到A.terreusCICC 40205-6-12,以葡萄糖为碳源衣康酸产量可达25.60 g/L,产酸量较原始菌株A.terreusCICC 40205-2-67提高49.00％;糖酸转化率达到32.00％,较原始菌株提高41.16％;且A.terreus CICC 40205-6-12菌株较原始菌的副产物（柠檬酸、乙醇、琥珀酸）产量明显降低。 其次，优化了菌株A.terreus CICC 40205-6-12产衣康酸的发酵过程。对土曲霉孢子悬液浓度、种子培养时间进行优化，确定最佳孢子悬液浓度为8×108CFU/mL,种子培养时间为24 h,优化后菌株生长状态良好，此外，依次探究了发酵培养基中碳源、氮源、MgSO4 · 7H2O、KH2PO4的最适添加量，结合响应面法优化，确定了最优的发酵培养基为葡萄糖60.56 g/L、NH4NO3 2.38 g/L、玉米浆 2.38 g/L、MgSO4 · 7H2O 2.88 g/L,衣康酸产量提高至28.40 g/L,糖酸转化率达到46.9％,较原始条件提高了46.56％。 最后，对原始菌株和筛选菌株A.terreus CICC 40205-6-12的关键基因转录水平进行了分析，明确了影响土曲霉合成衣康酸的关键基因。利用qPCR对糖酵解模块、衣康酸前体合成模块、衣康酸合成及降解模块、膜转运蛋白模块中关键基因的转录水平进行分析，发现顺乌头酸脱羧酶是衣康酸合成的关键调控酶，而衣康酸降解模块对衣康酸积累影响较小;甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸果糖激酶-1调控的过程是葡萄糖代谢的关键过程;柠檬酸合成酶和顺乌头酸酶是影响衣康酸前体合成的关键，并间接调控衣康酸的合成。上述结果为土曲霉的基因工程改造以及提高衣康酸的合成效率奠定了理论基础。
衣康酸;发酵工艺;土曲霉菌种;高通量筛选
北京化工大学
硕士
生物与医药
王芳;余军阳
2023
中文
TQ921
2023-09-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）