4--羟基香豆素苷的生物合成
4-羟基香豆素具有抗凝血功能，用于治疗血栓栓塞性疾病，是抗凝血药物华法林的重要直接前体，也可用于抗癌、杀鼠、制作合成香料等,具有重要的应用价值。传统的化学合成法成本高、工艺复杂、需要高温高压且收率低，生物合成4-羟基香豆素及其衍生物具有重要意义。 本研究利用合成生物学技术和策略，优化了生物合成4-羟基香豆素的菌株，实现了 4-羟基香豆素的高产。通过大肠杆菌BW25113基因组改造(整合莽草酸上游途径关键基因aroGfbr并敲除降解合成途径中间产物的硫酯酶基因ydiI)、4-羟基香豆素合成质粒模块优化、发酵培养基组分优化，实现了目前生物合成4-羟基香豆素的最高产量1157 mg/L。 初步实现4-羟基香豆素的高产，但其较高的细胞毒性成为进一步提高4-羟基香豆素产量的瓶颈。为解决4-羟基香豆素细胞毒性高的问题，本研究通过筛选四种糖基转移酶得到OsSGT1,成功将4-羟基香豆素转化为低细胞毒性的4-羟基香豆素苷,添加实验胞内糖基化效率为0.65％。体外纯化OsSGT1进行酶动力学分析，得知该酶对4-羟基香豆素的kcat/Km=0.45mM-1min-1。 分别采用添加分子伴侣、载体优化、培养基组分优化等方式，增强OsSGT1胞内糖基化效率，添加实验胞内糖基化效率接近100％。进行发酵罐培养制备糖苷产品，分别添加5g/L、10g/L、20g/L不同浓度的4-羟基香豆素底物，糖基化效率随底物浓度降低，分别为96.7％、59.5％和1.37％,用发酵罐细胞液制备4-羟基香豆素苷产品，纯度可达92％。 将OsSGT1引入从头合成4-羟基香豆素途径，经质粒模块优化和启动子优化，首次实现了生物合成4-羟基香豆素苷，产量达到1793 mg/L。通过酸水解和酶水解对4-羟基香豆素苷的水解进行研究:测试不同温度、乙醇浓度、酸浓度对4-羟基香豆素苷水解的影响，水解率达到32.0％;筛选大肠杆菌内源性糖苷水解酶，糖苷水解率达18.6％。
4-羟基香豆素苷;生物合成;菌株优化;药物产量
北京化工大学
硕士
生物与医药
刘艳辉;李强
2023
中文
TQ464.3
2023-09-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）