贝氏柯克斯体半固体平板法培养和质粒编码关键基因的筛选鉴定
目的：贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii,简称Cb）是一种人畜共患菌，为医疗及畜牧业带来了极大的困扰。本项目拟解决以下三个技术或科学问题:（1）Cb现有的克隆分纯方法为琼脂糖双层半固体平板法,该方法操作技术难度大且最多只能培养7天。本研究首先建立一种可长时间培养Cb的克隆分纯方法;（2）本实验室前期通过构建pQGK穿梭载体得到了 Cb内源质粒QpH1缺失突变体，发现QpH1是Cb感染小鼠巨噬细胞的关键毒力因子。在此基础上，本研究将筛选鉴定QpH1编码的关键毒力基因;（3）QpH1质粒的复制与分裂机制缺乏研究，本项目前期制备的pQGK质粒为研究上述生物学机制提供了模型。本项目将进一步深入研究与QpH1质粒复制分裂相关的基因和DNA序列。 结果：（1）通过甲基纤维素半固体平板成功建立了新的Cb克隆分纯方法。利用此方法分析了不同培养方法对Cb存活率和活力的影响，发现无细胞培养与细胞培养的Cb菌有相似的存活率，但无细胞培养法菌体有较低的活力;（2）基于pQGK构建了 8个QpH1保守基因的回补载体，并成功转化进Cb质粒缺失突变体。这八个基因分别是CBUA0006、CBUA0007、CBUA0010、CBUA0011、CBUA0012、CBUA0013、CBUA0023和CBUA0027。利用转化菌感染原代BMDM细胞，发现CBUA0013是Cb感染鼠巨噬细胞的关键基因。而且，我们进一步验证了 Cb质粒缺失突变体以及回补菌在ACCM2、BGM、THP-1和C57 BMDM细胞系中无明显的生长缺陷。说明质粒编码CBUA0013是Cb感染鼠原代BMDM细胞的关键基因。CBUA0013基因提前终止突变体pQGK-CBUA0013mt在原代BMDM细胞中的增殖情况与Cb质粒缺失突变体相似。在C57 BMDM细胞系中，Cb野生菌、Cb质粒缺失突变体和上述转化菌有相似的增殖能力，但只有Cb野生菌、CBUA0013和CBUA0023的回补转化菌可以形成在相差显微镜下可见的Cb增殖囊泡。（3）基于pQGK载体，构建了 CBUA0036-0039a基因的一系列截短突变体与提前终止突变体，转化Cb菌质粒缺失突变体和Cb野生菌。检测质粒突变体是否可以稳定转化、是否可以与内源QpH1质粒共存，综合分析pQGK的复制与分裂机制。发现当截短突变片段包含QpH1质粒32353nt-32930nt时内源质粒和重组质粒均能在Cb共存;CBUA0037、CBUA0038提前终止突变体中重组质粒可与内源质粒 QpH1 共存，CBUA0036、CBUA0038、CBUA0039、CBUA0039a 提前终止突变体中重组质粒均存在，而内源质粒QpH1均丢失。 结论：（1）建立了新的Cb克隆分纯方法，发现无细胞培养与细胞培养的Cb菌有相似的存活率，但无细胞培养法菌有较低的活力，无细胞培养法获得的菌体不适用于感染实验;（2）CBUA0013基因提前终止突变体pQGK-CBUA0013mt在原代BMDM细胞中的增殖情况与Cb质粒缺失突变体相似。以上结果说明质粒编码CBUA0013是Cb感染鼠原代BMDM细胞的关键基因。（3）Cb菌QpH1质粒的复制起始位点序列定位于CBUA0036-37之间;（4）CBUA0037-38基因是内源质粒QpH1复制与分裂的关键基因;（5）多种pQGK质粒截短突变体可与内源质粒QpH1在Cb菌中共存，为Cb研究提供了新的遗传操作工具。
贝氏柯克斯体;菌株培养;半固体平板法;质粒编码;基因筛选
北京化工大学
硕士
生物与医药
宋立华;黄莺
2023
中文
R378
2023-09-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）