穿山甲冠状病毒致死模型和重组亚单位疫苗研究
背景与目的：在新冠疫情爆发前，我们实验室分离培养了穿山甲冠状病毒GX_P2V,该病毒的基因组序列与新冠病毒SARS-CoV-2基因组序列有较高的同源性。我们前期研究发现GX_P2V在细胞感染和金黄地鼠感染中均已高度减毒，且其感染动物后可以诱导抗新冠病毒交叉中和抗体。另外，据文献报道GX_P2V刺突蛋白的受体结合域(Receptor Binding Domain,RBD)与hACE2有强结合能力。本课题从以下两方面对GX_P2V开展了研究:(1)本课题首先研究了GX_P2V病毒对ACE2人源化小鼠的致病性;(2)原核可溶性表达纯化SARS-CoV-2和GX_P2V RBD,测试原核重组RBD用于制备亚单位疫苗的可行性，以及分析GX_P2V RBD和SARS-CoV-2 RBD是否有交叉中和表位。 结果：(1)GX_P2V病毒(1×105 TCID 50)滴鼻感染ACE2人源化小鼠，导致小鼠在感染后7-9天内全部死亡。qPCR数据表明病毒主要侵染脑部和肺部，噬斑实验也检测到脑部和肺部的活毒。特别是感染后第六天起脑部有高滴度活病毒。病理分析发现，肺部无明显病变，但脑部病变显著。免疫组化分析发现脑部存在严重病毒感染。脑部趋化因子CXCL11在感染3和6天出现明显下调。分析原因可能是病毒感染导致脑炎，造成小鼠死亡;(2)用pGEX-4T-1载体重组表达GX_P2V RBD融合蛋白GST-SADS NC188-P2V RBD。该融合的N端依次为GST标签和SADS-CoVN蛋白C端的第188个氨基酸(NC188)为标签。融合蛋白可以结合hACE2,免疫小鼠制备的血清可中和GX_P2V假病毒，但不能中和SARS-CoV-2假病毒。体内测试结果显示，免疫与未免疫重组GX_P2V RBD的金黄地鼠，攻毒后病毒拷贝数无明显差异;(3)用pET-40b载体融合表达 SARS-CoV-2和GX_P2V RBD,分别为 Dsbc-P2V RBD 和Dsbc-SARS-CoVRBD。两种融合蛋白可以在大肠杆菌中可溶性表达。用两种不同的重组RBD分别免疫ACE2人源化小鼠后用GX_P2V做攻毒实验，小鼠在7～9天全部死亡，体重在第五天开始明显持续下降。 结论：(1)GX_P2V病毒对ACE2人源化小鼠有高致病性，提示该病毒有潜在的人兽共患风险;(2)可以用E.coli高效表达纯化GX_P2V和新冠病毒的RBD;(3)GX_P2V RBD免疫小鼠可以产生低效价抗GX_P2V中和抗体，但不产生抗新冠病毒交叉中和抗体;(4)GX_P2V RBD免疫ACE2人源化小鼠不能产生有效的免疫保护，提示原核表达RBD的方式可能存在缺陷或者需要进一步改进。
穿山甲冠状病毒;致死模型;蛋白纯化;重组亚单位疫苗
北京化工大学
硕士
生物与医药
宋立华;黄莺
2023
中文
R373
2023-09-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）