人源MIF蛋白单克隆抗体的研制及其初步应用
人巨噬细胞移动抑制因子(Human macrophage migration inhibitory factor,hMIF)是1966年发现的一种极其重要的多效调控细胞因子，组成性表达于全身多种组织细胞。近数十年的研究发现，MIF除发挥细胞因子的基本功能外，还参与调节信号通路、先天性和获得性免疫应答、炎症反应，影响细胞增殖、凋亡和吞噬，具有类似酶、激素、生长因子、应激反应蛋白等多重作用。MIF还与脓毒血症、自体免疫性疾病、风湿性关节炎、感染性休克以及肿瘤等众多疾病的发生发展有重要关系。目前hMIF单克隆抗体(Monoclonal antibody,MAb)虽研究较多，但获得反应性较好的检测抗体和建立一种高通量、快速检测MIF含量的方法仍具有重要意义。本研究主要内容包括: 1.hMIF蛋白原核表达与纯化:根据NCBI公布的hMIF蛋白cDNA序列(NCBI Reference Sequence:NM_002415.2)设计一对特异性扩增引物，经RT-PCR从人外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中扩增出片段并构建至原核表达载体 pET-11b 上。重组质粒 pET11b-hMIF 转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3),经 IPTG诱导表达后，利用Ni-NTA亲和层析与凝胶过滤层析进行纯化，并测定其互变异构酶活性，SDS-PAGE凝胶电泳显示得到纯度较高、可溶性表达、分子量为13.3 kDa的重组目的蛋白，重组蛋白分子量符合预期。 2.hMIF蛋白单克隆抗体的研制:将纯化的His-hMIF重组蛋白作为免疫原免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，三次免疫后，利用棋盘方阵间接酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法确定最适抗原包被浓度为1.25 μg/mL,最适血清稀释度为1∶12800,随后将血清抗体效价最高的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。利用间接ELISA和间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)方法同时检测杂交瘤细胞培养上清，并构建了 pLVX-AcGFP-N1-hMIF过表达载体，转染后获得瞬时过表达hMIF的人胚胎肾细胞HEK293T,用于筛选hMIF单克隆抗体(以下简称单抗)。经过3次有限稀释法亚克隆，获得了 3株能稳定分泌抗hMIF蛋白单抗的细胞株，分别命名为1G2、2G4和2G11。通过免疫印迹(Westernblot,WB)鉴定3株单抗的特异性，结果显示1G2、2G4均能与免疫原His-hMIF蛋白和组织细胞MIF蛋白发生特异性反应，2G11则无反应。IFA试验结果显示，单抗1G2、2G4和2G11均能特异性识别健康HEK 293T细胞、A549细胞和瞬时过表达hMIF的HEK 293T细胞，出现特异性荧光。间接ELISA和IFA方法检测1G2、2G4和2G11杂交瘤细胞培养上清效价，结果显示，1G2、2G4和2G11的细胞上清ELISA效价分别为1∶6400、1∶1600和0,荧光效价分别为1∶1600、1∶400和1∶800。单抗与其他蛋白无交叉反应，且能稳定分泌抗体，亚类鉴定结果显示，单抗1G2、2G4和2G11重链分别属于IgG2a、IgG1和IgM亚型，其轻链均为κ亚型。 3.单抗抗原表位鉴定与hMIF双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立:通过构建逐步截短pGEX-6P-1-hMIF表达载体，经Western blot最终确定单抗1G2和2G4的抗原表位分别为30ATGKPPQY37和11PRASVPP17。制取腹水后通过辛酸硫酸铵纯化，以辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标记1G2和2G4,通过抗体配对确定以1G2单抗为捕获抗体，HRP-2G4为检测抗体，对His-hMIF重组蛋白作为检测抗原进行了夹心ELISA检测条件的优化。确定捕获抗体1G2最适包被浓度为2.5 μg/mL、检测抗体HRP-2G4以1∶1600稀释、包被条件为4℃ 16h、封闭液选择5％脱脂奶粉(Skimmed milk powder,SMP)、封闭时间为120 min、抗原孵育时间为60 min、检测抗体孵育时间为60min和显色反应时间为20 min。此方法特异性较强，其检测线性范围为10ng/mL-12500 ng/mL(y=0.0012x+0.19165,R2=0.95063),敏感性较好，检测限为 5.54 ng/mL(2σ),批内、批间重复性较好，变异系数均小于10％。 4.hMIF蛋白单克隆抗体在敲低和过表达MIF蛋白HEK 293T细胞系建立中的应用:应用研制的单抗，利用激光共聚焦技术定位HEK 293T细胞中MIF蛋白存在于细胞质中。通过构建pX458-hMIF敲低载体与pLVX-AcGFP-N1-hMIF过表达载体，转染HEK 293T后，利用流式细胞术与慢病毒包装技术得到敲低和过表达hMIF的细胞，亚克隆得到稳转细胞系，经Western blot验证MIF变化。利用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激过表达和敲低细胞后发现，hMIF正向激活ERK1/2磷酸化，与前人研究结果一致。
人巨噬细胞移动抑制因子;单克隆抗体;细胞融合;生物学功能
扬州大学
硕士
微生物学
高崧
2023
中文
Q813.2
2023-09-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）