血糖敏感型纳米纤维支架的制备及其体外成骨性能研究
目的: 牙槽骨缺损伴有糖尿病患者是临床治疗的一大难点，高血糖状态会严重阻碍目前局部骨组织的修复。近年来，载药纳米纤维支架的兴起为牙槽骨缺损的修复提供了一种新的方法，但传统的载药支架是一种缓释的方式，不能满足高糖微环境下对治疗药物日益增长的需求，存在一些不足。血糖敏感系统与纳米纤维支架结合是一种具有潜力的治疗方法。该体系的原理是葡萄糖氧化酶（GOD）将葡萄糖催化产生葡萄糖酸，引起材料局部内外渗透压的变化，进而产生材料体积的差异，导致活性分子药物释放量的变化。为了发挥血糖敏感性，将GOD固定在支架基质上是关键的一步。然而，经过我们之前的研究表明，戊二醛（GA）这种常用的交联剂对细胞造成不利的毒性影响。我们假设共价连接加交联可能是提高GOD稳定性和数量的有效途径。本研究的目的是选择天然生物交联剂京尼平（GnP）固定GOD,通过酶相关性能评价和生物相容性探讨其有效性，最后通过建立体外高糖环境评价该血糖敏感纳米纤维促进成骨的效果。 方法: 本实验首先通过静电纺丝的方法制备了聚己内酯/壳聚糖（PCL/CS）纳米纤维，在此基础上利用京尼平（GnP）将葡萄糖氧化酶（GOD）固定于负载了地塞米松（DEX）的纳米纤维制备成血糖敏感纳米纤维（GnP-NF）。之后通过傅立叶变换红外吸收光谱（FTIR）分析了 GOD和纳米纤维支架的相互作用，表明其是否固定于纳米纤维，也测定了纳米纤维的孔隙率和载药率，此外还测定了纳米纤维在载药后和GnP处理后的力学性能。接着比较了通过直接浸泡法（P-NF）,戊二醛处理法（GA-NF）、GnP固定法固定GOD之后酶的活性、结合能力和稳定性以便于评价GOD固定后的有效性。之后将血糖敏感纳米纤维浸泡于不同浓度的葡萄糖溶液（0mM、5mM、12mM、15mM）后通过扫描电镜（Scanning Electron Microscope,SEM）和药物释放的方法分析其孔径变化和药物释放速率来评价血糖敏感纳米纤维的血糖敏感性。小鼠胚胎前成骨细胞（MC3T3-E1）接种于纳米纤维上培养一段时间后通过细胞增殖检测（Cell Counting Kit-8,CCK-8）分析其细胞活力，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察MC3T3-E1的生长情况，综合评价纳米纤维的生物相容性。最后，通过上述实验筛选出血糖敏感性较好的纳米纤维在体外高糖环境下与MC3T3-E1共培养,通过碱性磷酸酶活性（ALP）测定，茜素红染色（ARS）以及半定量测定来评价其促进成骨的效果。 结果: 1.经过FTIR表征发现，PCL/CS成功制备，DEX也被负载到纳米纤维，最重要的是GOD成功被固定在纳米纤维上，经过孔隙率和载药效率测定表现为高的孔隙率（＞90％）和较高的载药效率（85.51±1.21％）。 2.在力学性能测试中负载了 DEX的纳米纤维和GnP处理的纳米纤维力学性能均有所提升且后者提升高于前者。另外，通过GOD活性、结合能力和稳定性测试发现，GnP-NF的酶活性高于GA-NF和P-NF且固定的酶量也多于GA-NF和P-NF,但是稳定性表现中GnP和GA-NF差异不明显均比P-NF稳定。在血糖敏感测试中不同血糖敏感纳米纤维（GnP-NF、GA-NF、P-NF）在浸泡于不同浓度葡萄糖溶液（0mM、5mM、12mM、15 mM）后经过SEM观察发现各组纳米纤维的直径随着葡萄糖浓度的增加均有所增加，Image J分析在15mM葡萄糖溶液中GnP-NF直径由146.5 nm变为258.8 nm,而P-NF和GA-NF分别增加到195.8 nm和204.4 nm。进一步经过药物释放速率测定发现DEX的释放随着葡萄糖浓度的增加而增加，表现出葡萄糖浓度依赖性，说明GnP-NF能在高糖浓度条件下发生膨胀，增加药物释放，展现出良好的血糖敏感性。 3.体外生物相容性测试中CCK-8结果表明，GA的处理降低了细胞的活力，减少细胞存活，而GnP处理组仍然具有较高的细胞活力。进一步通过共聚焦激光扫描显微镜观察MC3T3-E1在GA-NF上生长形态有所改变，活力降低，而在GnP-NF上良好生长，具备良好的生物相容性。在体外使用了高糖浓度的培养基模拟高血糖环境,成骨实验结果显示各组ALP活性虽均有所降低但GnP-NF组高于只负载DEX组和PCL/CS组，茜素红染色中GnP-NF产生的钙结节更多且范围更广，半定量测定也表明该纳米纤维能在高糖浓度下促进成骨细胞的增殖和分化。 结论: 本实验以PCL和CS为原料通过静电纺丝技术制备了纳米纤维，负载DEX后经过GnP介导的一步酶固定法将GOD固定于纳米纤维中，获得了血糖敏感纳米纤维(GnP-NF)。相关结果表明:GnP-NF能对高糖浓度做出反应，快速发生膨胀使直径增加，内部孔径增加，进而控制DEX的快速释放，表现出良好的血糖敏感性。该纳米纤维支架不仅具有合适的力学特性和很好的生物相容性，还能够允许细胞黏附生长。在体外高糖环境下显示出较好的促进成骨能力。研究结果表明GnP处理法是一种效果好且细胞毒性低的固定GOD的方式，同时赋予纳米纤维支架较好的血糖敏感性具有用于糖尿病牙槽骨缺损修复的巨大潜力。
血糖敏感型纳米纤维支架;制备工艺;体外成骨性能;生物相容性
山西医科大学
硕士
口腔临床医学
王翔宇;刘君瑜
2023
中文
R318.08
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）