硫酸软骨素诱导胶原纤维矿化的机制及其在异位骨化中的作用研究
目的: 硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate,CS) 是矿化组织中重要的细胞外基质成分，它可以调控牙本质生成和骨形成，还可用于骨组织工程，具有促进骨缺损修复的潜力。然而，CS调节生物矿化的方式尚不明确。本研究通过体外仿生矿化手段联合多种表征技术探究了 CS对矿化的调节作用，并利用分子动力学模拟对作用机制做出解释。在此基础上发现了 CS沉积与跟腱病理性钙化的发生具有相关性。这一结果将进一步拓宽CS在组织工程中的应用前景，也将为异位钙化相关疾病的治疗提供新思路。 方法: 在第一部分实验中，通过H&E染色、阿尔新蓝染色、1,9-二甲基亚甲蓝(1,9-Dimethylmethylene Blue,DMMB)定量分光光度法以及激光扫描共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy,CLSM)表征了 CS 与异位骨化(Heterotopic Ossification,HO)的关系。 在第二部分实验中，首先利用体外仿生矿化手段，将不同浓度CS分别与高浓度钙磷溶液混合及配比，最终确定了可以形成无定形磷酸钙(Amorphous Calcium Phosphate,ACP)的最适 CS 浓度;使用动态光散射(Dynamic Light Scattering,DLS)及zeta电位检测CS-ACP的水合直径及电位大小;通过透射电镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)、能量色散光谱仪(Energy Dispersive Spectrometer,EDS)联合选区电子衍射(Selected Area Electron Diffraction,SAED)分析样品中的颗粒形貌、元素分布及矿物晶型。 在第三部分实验中，将二维胶原矿化模型(Ⅰ型鼠尾胶原)及三维胶原矿化模型(牛跟腱来源Ⅰ型胶原支架)与实验二中所制备的CS-ACP矿化液共孵育，进而评估不同浓度CS介导胶原纤维内矿化的能力及矿化的效率;利用TEM表征矿物的沉积位置，明确胶原纤维矿化的形式;利用扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)结合能量色散X射线光谱(Energy Dispersive X-Ray,EDX)观察胶原纤维矿化前后形态变化以及元素分布;通过X射线衍射(X-Ray Diffraction,XRD)鉴定纤维内矿物质晶型，热重分析(Thermogravimetric Analysis,TGA)检测胶原纤维矿化程度，傅里叶红外光谱(Fourier-Transform Infrared Spectroscopy,FTIR)进一步明确纤维内矿物质的成分;采用分子动力学模拟再现了 CS-ACP的形成过程。 在第四部分实验中，首先将CS交联至氨化玻璃表面构建了固定化的CS模型。利用CLSM验证了 CS与玻璃载体的结合;利用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测玻璃载体与CS是否形成了稳定的化学交联;在此基础上利用SEM和TEM研究结合状态的CS对胶原矿化的影响。 在第五部分实验中，利用CLSM表征了钙化区域中透明质酸酶-1(Hyaluronidase-1,HYAL1)和矿化的相关性;利用软骨素酶ABC(Chondroitinase ABC,ChABC)模拟体内HYAL1对CS的特异性水解作用，并通过DMMB测定法估计了不同消化时间下水解产物中CS的量;用SEM进一步探索了在体外环境下游离CS能否诱导跟腱组织矿化。 结果: 1 第一部分:跟腱HO与CS沉积具有相关性 术后6周的大鼠跟腱组织切片H&E染色表明HO模型构建成功;阿尔新蓝染色以及DMMB分析表明，与对照组相比异位骨化区酸性GAG含量增加;CLMS结果显示跟腱钙化区CS与Ca有明显的共定位。 2 第二部分:CS-ACP的形成及表征 添加了 2 mg/mL 游离 CS 的过饱和磷酸钙(Supersaturated Calcium Phosphate Solution,Cap)溶液在静置三天后呈浑浊状态，TEM结果显示颗粒聚集成针状，流体动力学直径为复杂的多峰结构。添加了 3 mg/mL和5 mg/mL游离CS的CaP溶液静置三天后保持澄清;随着CS浓度的增加，TEM结果显示纳米颗粒更为分散均匀，其直径也随CS浓度的增加而增大。由于CS的电负性，CaP溶液的zeta电位随着CS浓度的增加而略有变化。高角环形暗场-扫描透射电子显微镜(High-Angle Annular Dark-Field Scanning Transmission Electron Microscopy,HAADF-STEM)结合纳米颗粒的元素图谱表明钙、磷元素与CS来源的硫元素分布一致。SAED结果表明纳米颗粒处于无定形状态。以上结果说明，游离状态的CS能够以浓度依赖的方式稳定CaP溶液并形成CS-ACP纳米颗粒。 3 第三部分:CS-ACP可以诱导胶原纤维矿化 TEM结果显示，二维胶原纤维在与CS-ACP共孵育24小时后就观察到了明显的纤维内矿化，在第3天时纤维内矿化更为广泛。在矿化培养基中孵育5天后，三维胶原海绵的TEM图像显示矿物质晶体渗透到了胶原纤维内部。EDX分析表明，钙、磷和硫的位置与SEM图像中矿化胶原的位置重合。XRD结果显示在25.86(°2θ)衍射角处存在HAp特征性的002衍射峰，FTIR结果观察到了磷酸基团O-P-O峰的伸缩和弯曲振动，TGA检测结果表明在CS-ACP中浸泡5天后胶原海绵的矿物质含量达到40.4％。以上研究证实，CS-ACP可以引起胶原纤维内矿化，并具有优异的矿化诱导效率。同时，SEM和TEM结果表明，CS-ACP诱导纤维内矿化的能力呈现出浓度依赖性，CS浓度较低(1 mg/mL和2 mg/mL)时，纤维内矿化无法实现。分子模拟结果揭示了CS-ACP的形成机制。CS分子之间的氢键提供了启动CS自组装的能量来源，之后CS通过静电相互作用募集环境中的Ca2+离子，进一步促进了CS组装过程。向体系中添加HPO42-离子后，CS周围的Ca2+和HPO42-离子数量均随着模拟时间的延长而增加。继而Ca2+和HPO42-离子在静电相互作用下聚集在CS周围形成CS-ACP。 4 第四部分:结合状态的CS对胶原矿化的影响 CLSM观察发现CS结合至氨化玻璃表面。HPLC并未检测到氨化玻璃储存液中CS的洗脱峰，这一结果表明，玻璃载体与CS通过化学交联形成稳定的共价键，环境中没有游离CS的存在。当胶原纤维在含有固定CS的矿化液中浸泡3天后，SEM和TEM的结果均表明，羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HAp)晶体沉积仅沉积在胶原纤维表面，胶原纤维显示出未矿化的形态，其周期性横纹结构清晰可见。以上结果表明,结合状态的CS并不具备诱导胶原纤维内矿化的能力。 5 第五部分:游离的CS可以诱导跟腱胶原纤维矿化 跟腱异位钙化区的免疫荧光染色结果表明HYAL1和CS在钙化区域内共沉积，因此推测游离CS可能来源于HYAL1的水解作用。在体外使用ChABC酶解跟腱组织，DMMB结果表明水解产物中CS的含量随着水解时间的延长而显著增加。随后将处理过的跟腱组织在含有游离CS的矿化培养基中孵育，SEM结果显示，跟腱胶原纤维发生纤维内矿化，其矿化程度随酶解时间增加而加深。以上结果表明，游离的CS在体外可以诱导跟腱胶原的纤维内矿化。 结论: 本研究提出了CS调节胶原矿化的创新性机制，CS的存在形式（游离或结合）会显著影响胶原矿化的结果。游离状态的CS可以稳定CaP矿化系统，实现广泛的胶原纤维内矿化。当CS通过化学交联固定到玻璃板上以模拟体内结合状态的CS后，它不能发挥诱导胶原纤维内矿化的作用。游离CS促进胶原矿化的能力为开发全新的仿生矿化材料提供了新策略，也为病理性钙化疾病的靶向治疗提供了新方向。
异位骨化;硫酸软骨素;胶原纤维矿化;病理机制
山西医科大学
硕士
口腔临床医学
贾静;牛丽娜
2023
中文
R681.02
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）