双载药纳米纤维支架的制备及体外促进成骨作用的研究
目的: 牙周病引起的牙槽骨缺损是一种严重的口腔疾病，会导致牙齿松动和脱落，因此牙槽骨缺损的修复是一项重大的临床挑战。而在复杂的骨再生过程中，成骨分化和血管生成至关重要。本研究中，使用聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)装载成血管因子牛磺熊过氧胆酸(Tauro-ursodeoxycholicacid,TUDCA)和成骨因子地塞米松(Dexamethasone,DEX)来制备新型双小分子静电纺纳米纤维支架，以期在骨修复过程中同时发挥其诱导作用促进早期血管生成和成骨。这种方式有望实现支架材料更好的血管生成和成骨活性，并促进骨愈合过程。 方法: 在这项研究中，通过静电纺技术制备了 PCL、TUDCA/PCL、DEX/PCL和TUDCA/DEX/PCL纳米纤维骨修复支架。探索了加入成血管因子(TUDCA)和成骨因子(DEX)对纳米纤维骨修复支架结构性能的影响。 1、通过载药纳米纤维支架的释药实验观察了其药物释放的规律。通过扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)、水接触角实验仪及万能材料实验机对纳米纤维骨修复支架的镜下微观形貌与结构、亲水性能及力学性能进行表征及比较。 2、在各组支架上分别接种培养小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)和人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)。利用激光共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope,LSCM)观察鬼笔环肽-DAPI染色后的两种细胞，并记录拍摄两种细胞的形态与黏附情况。利用活/死细胞染色观察两种细胞数量增殖情况及通过细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)评测双载药纳米纤维骨修复支架的细胞生物相容性。 3、经过碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性测定实验及茜素红染色(Alizarin red staining,ARS)实验，观察碱性磷酸酶及染色钙结节的数目及大小来评价负载双载药纳米纤维骨修复支架在体外诱导MC3T3-E1成骨向分化的能力。 4、利用Transwell药物释放装置，探索载药纳米纤维支架中药物对HUVECs的影响，并且通过体外伤口愈合实验和管形成实验对载药纳米纤维支架在体外诱导HUVECs成血管分化的能力进行评估。 结果: 1、四组纳米纤维支架在宏观上没有区别，均具有白色的外观和良好的柔韧性,微观扫描电子显微镜显示TUDCA/DEX/PCL纳米纤维支架的纤维表面光滑。对直径分布的数据分析表明，所有静电纺纳米纤维的平均直径约为125nm-150nm,说明可使用静电纺技术成功制备纳米级纤维支架。通过统计分析，TUDCA和DEX的引入使直径略有增大，但直径和直径分布没有显著差异。SEM图像显示了这些纳米纤维之间形成了许多无序互连的孔隙网状结构。万能材料实验机测试结果显示与PCL支架相比，载药纳米纤维支架的杨氏模量降低，材料刚度和极限拉伸应力相应降低。四种支架之间的水接触角(Water Contact Angle,WCA)没有显著差异，纯PCL纳米纤维支架和DEX/PCL纳米纤维支架的WCA平均约为121°。载药纳米纤维支架的药物释放实验表明，在初始药物释放期间，亲水性药物TUDCA的释放速率高于疏水性药物DEX。并且药物均可缓慢持续释放超过528h。 2、体外细胞实验表明，实验组与对照组的纳米纤维骨修复支架均具有较好的细胞生物相容性，HUVECs及MC3T3-E1均可在支架上黏附生长增殖。CCK-8细胞增殖实验结果显示，在不同支架中孵育的HUVECs和MC3T3-E1细胞在不同时间段内增殖，含有TUDCA和DEX的双载药纳米纤维支架上的细胞数量高于其他支架，并且在各个培养组中双载药纳米纤维骨修复支架组均具有最高的细胞增值速率。此外，使用鬼笔环肽-DAPI对支架上分别接种的两种细胞进行染色，接着利用LSCM观察，其结果显示各组纳米纤维支架上两种细胞均可以稳定黏附和生长。另外，对四组纳米纤维支架分别接种两种细胞进行活/死细胞染色，实验结果也验证了双载药纳米纤维支架可以有效促进两种细胞的黏附与生长。以上实验结果均证明双载药纳米纤维骨修复支架良好的生物相容性，可以极大地促进细胞在支架上的的粘附生长和增殖。 3、体外进行伤口愈合实验，HUVECs的迁移图像显示，在培养24h后，这些纳米纤维支架影响下的伤口区域（无细胞空隙区域）距离处的迁移程度不同，TUDCA/DEX/PCL纳米纤维支架组迁移最为明显。此外，管形成实验表明，12h后在这些纳米纤维支架的作用下显示HUVECs不同程度的毛细血管网络，TUDCA/PCL纳米纤维支架和TUDCA/DEX/PCL纳米纤维支架组形成明显细长的管状结构，TUDCA/DEX/PCL支架形成了最明显的毛细血管网络。体外成骨诱导分化实验结果显示，TUDCA/DEX/PCL纳米纤维骨修复支架上MC3T3-E1细胞的ALP活性表达和钙盐沉积量均高于PCL、TUDCA/PCL、DEX/PCL纳米纤维支架，表明双载药纳米纤维骨修复支架的成骨诱导活性是最高的。 结论: 1、本研究首次探讨了小分子成骨因子（DEX）和成血管因子（TUDCA）的联合作用，将DEX和TUDCA共同加载到生物相容性较好的PCL聚合物溶液中，采用静电纺技术成功制备一种新型双载小分子药物的纳米纤维支架，该支架具有良好的力学性能和合适的亲水性。 2、双载药纳米纤维支架具有良好的细胞生物相容，能够有效地促进细胞在双载药纳米纤维支架上的粘附和增殖，从而提高细胞的生存率和活力。双载药纳米纤维支架中亲水性药物TUDCA早期快速释放，同时疏水性药物DEX缓慢释放。 3、双载药纳米纤维支架具有稳定良好的成骨诱导作用，和促血管生成的作用。这种方式有望实现支架材料更好的血管生成和成骨活性，并促进骨愈合过程，并且有望进一步开发为促进牙槽骨修复的支架材料。
双载药纳米纤维支架;制备工艺;血管生成;成骨活性
山西医科大学
硕士
口腔临床医学
王翔宇;刘君瑜
2023
中文
R318.08
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）