颌骨骨髓间充质干细胞外泌体通过miR--126a--5p调控Hoxa11影响跨胚层游离骨移植愈合的机制研究
目的: 临床上，大面积的骨缺损是口腔软硬组织修复面临的巨大挑战，每年大概1300万的骨缺损患者中，大于25毫米的骨缺损仅有10％的几率能够自愈。通过自体移植游离的四肢骨植骨块是修复颌骨大面积缺损的最好方法，然而术后仍有5％-10％的患者出现愈合延迟。为了优化目前的疗法，对自体游离骨移植愈合机制的探索十分必要。 从胚胎发育学的角度讲，颌面骨是通过膜内骨化过程从神经嵴衍生出来的;四肢骨是通过软骨化骨过程从中胚层衍生形成的。从细胞功能来讲，四肢骨来源的骨髓间充质干细胞(Bonemesenchymalstemcells,BMSCs)表达同源盒结构基因a11(Homeoboxa11gene,Hoxa11),而颌骨BMSCs(Mandiblemesenchymalstemcells,M-MSCs)几乎不表达Hoxa11;从干细胞分化的角度讲，M-MSCs的成骨分化能力高于四肢骨BMSCs。考虑到颌骨和四肢骨之间的这些差异，二者的骨愈合机制也可能不同。然而在颌骨与四肢骨的这种跨胚层游离骨移植中，颌骨受植床如何调控四肢植骨块内BMSCs分化，目前仍未研究。 本研究的目的是深入了解神经嵴源性的M-MSCs分泌出的外泌体(Mandiblemesenchymalstemcell-derivedexosomes,M-MSC-Exos)对跨胚层游离骨移植中骨生成的影响及相关作用机制，评估受植床的M-MSCs-Exos所负载的微RNA(microRNA,miRNA)货物通过调控骨移植微环境从而影响四肢骨植骨块的分化、愈合。本研究旨在通过初步揭示不同胚层源性的BMSCs外泌体相互通信、彼此调控的机制，开辟跨胚层游离骨移植的新思路。 方法: 1.建立大鼠自体颌骨-股骨游离移植的模型，使用骨形态分析系统对Masson、Goldner、H&E染色的石蜡切片进行分析，观察移植区的缺损填充情况、新生骨结构、类骨质相对含量和矿化骨相对含量;观察移植区缺损处的成骨活跃程度。 2.创建M-MSCs和股骨骨髓间充质干细胞(Femurmesenchymalstemcells,F-MSCs)的Transwell共培养体系;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-timepolymerasechainreaction,RT-qPCR)反映M-MSCs对F-MSCs的成骨影响效应。 3.超速离心提取了颌骨骨髓间充质干细胞分泌出的外泌体(Mandiblemesenchymalstemcell-derivedexosomes,M-MSC-exos);纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticletrackinganalysis,NTA)以及透射电镜(Transmissionelectronmicroscope,TEM)进行表征。 4.通过向M-MSCs和F-MSCs的Transwell共培养体系中加入外泌体抑制剂GW4869,配合RT-qPCR,验证了外泌体在模拟各个骨移植的细胞系统中起着信号通讯的作用。 5.运用了小RNA高通量测序平台，筛选M-MSC-exos和股骨骨髓间充质干细胞分泌的外泌体(Femurmesenchymalstemcell-derivedexosomes,F-MSC-exos)的内容物中小RNA表达量的区别，并筛选出具有统计学差异的且参与调控骨生成的miR-126a-5p。 6.运用慢病毒转染，对M-MSCs实施miR-126a-5p的敲低，共培养体系内探索miR-126a-5p敲低的M-MSCs对于F-MSCs成骨能力的影响。双萤光素酶报告基因检测证明miR-126a-5p与Hoxa11具有结合作用。 结果: 1.当同样的股骨植骨块移植到不同的受植床(下颌骨和股骨)时，移植区存在成骨的愈合差异。两组相比较:股骨植骨块移植修复下颌骨骨缺损后，新生骨骨小梁相互均匀交织，可见丰富的新生血管;成骨趋势增强，矿化骨成分相对较高，Runx2,OSX、OCN、Col-1等成骨标志表达较高。而股骨植骨块游离移植修复股骨缺损后，植骨块与受植床之间存在更多不规则的胶原排列，骨小梁排列紊乱，矿物质/有机基质比率相对较低，Runx2,OSX、OCN、Col-1等成骨标志表达相对较低。 2.通过建立M-MSCs和F-MSCs的共培养体系，RT-qPCR结果发现当M-MSCs微环境干预F-MSCs后，Runx2,OSX、OCN、Col-1等成骨标志有所上调。 3.M-MSCs和F-MSCs的共培养体系经过外泌体抑制剂GW4869干预后，RT-qPCR结果发现，当阻断掉颌骨微环境的外泌体时，F-MSCs原被上调过的成骨相关指标Runx2,OSX、OCN、Col-1等趋势被逆转，提示外泌体在细胞通讯水平上起到关键作用。 4.提取以及鉴定了M-MSC-exos,观察结构，测试粒径以及浓度。另外，对M-MSC-exos和F-MSC-exos进行了小RNA测序，当log2(FC)绝对值设置为大于1时可见M-MSC-exos和F-MSC-exos内容物中的miR-126a-5p表达量存在差异。 5.M-MSCs经miR-126a-5p敲低后，对F-MSCs的成骨分化促进作用被减弱，且有统计学意义;表明了外泌体内容物miR-126a-5p参与调控了跨胚层骨移植愈合。 6.M-MSC-exos中的miR-126a-5p通过靶向股骨的Hoxa11基因，促进股骨植骨块在颌骨受植床里的成骨愈合效应。 结论: 在股骨植骨块移植到颌骨受植床的自体跨胚层游离骨移植过程中，受植床内的M-MSCs可通过外泌体向植骨块的F-MSCs传递miR-126a-5p,调控F-MSCs的Hoxa11表达和成骨分化，从而促进了股骨植骨块和颌骨受植床的融合重建。
骨髓间充质干细胞;外泌体;成骨分化;自体骨移植
山西医科大学
硕士
口腔临床医学
王兴
2023
中文
R329.2
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）