假体周围感染方药规律数据挖掘与小檗碱对MRSA干预作用的体内、外研究
目的: 1.基于数据挖掘系统分析广州中医药大学第一附属医院假体周围感染(PeriprosthesisJointInfection，PJI)患者的首诊处方，归纳、总结其组方用药规律，为临床治疗提供依据。 2.明确小檗碱对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusAureus，MRSA)的体外抗菌、抗生物膜作用，并通过Agr二元信号转导系统及其介导的抗毒素机制与细菌粘附机制探讨其相应的分子生物学机理。 3.通过PJI动物模型评估小檗碱的体内抗MRSA及其生物膜的效果。 方法: 1.数据挖掘研究 收集2013年1月-2020年6月广州中医药大学第一附属医院PJI住院患者的首诊处方，采用IBMSPSS25进行药物频率分析，采用excel比对法对药物的四气、五味、归经及功效进行分析，采用IBMSPSSModeler18进行药物关联规则分析，采用SPSS25进行药物之间的聚类分析，采用Gephi对药物进行复杂网络分析。 2.体外实验研究 (1)提取临床MRSA菌株的基因组DNA，采用PCR法测序并将测序结果与数据库比对，确定临床来源MRSA的multilocussequencetyping(MLST)分型。 (2)测定小檗碱、万古霉素对MRSA的最小抑菌浓度(MinimalInhibitoryConcentration，MIC)及二者联合应用时的MIC。 (3)用荧光酶标仪分别测定浓度为MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC的小檗碱干预MRSA菌株后的OD值，并绘制生长曲线。 (4)构建MRSA菌株钛合金块表面生物膜，分别以浓度为MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、0的小檗碱对其进行干预，扫描电镜比较不同组别干预后生物膜形态学变化，活菌计数比较不同组别生物膜生长的组间差异，同时比较小檗碱对生长初期及成熟后(24h后)MRSA生物膜生长的差异。 (5)RT-qPCR测定小檗碱干预后AgrA、RNAⅢ、α-溶血素(α-hemolysin，hlα)、纤连蛋白结合蛋白B(FibronectinBindingProteinsB，FnbpB)、聚集因子A(ClumpingFactorsA，ClfA)等Agr二元调控及生物膜粘附基因的变化。 3.动物实验研究 取C57BL/6SPF级小鼠18只，平均分为三组，每组6只。对照组:单纯假体植入;PJI组:假体植入后同时种植MRSA菌株;实验组:假体植入后，种植MRSA菌株同时以小檗碱进行干预。术后观察小鼠基本情况，7天后比较血液白细胞(WhiteBloodCell，WBC)计数及中性粒细胞百分比(NeutrophilicGranulocytePercentage，NEUT％)的变化，比较不同组别关节内组织阳性率的差异，Micro-CT观察膝关节假体情况，扫描电镜观察假体表面细菌及生物膜情况，组织切片经苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin，HE)染色观察局部组织病理变化。 结果: 1.数据挖掘研究 (1)共纳入88首处方，使用药物共计110味。四气方面:用药最多的为寒性药物，共计41味，其次为温性药物（33味）。五味方面:用药为苦味药物的最多，共计57味，其次为甘味药物(51味)。归经方面:用药归属于肝经的最多，共计58味;其次为归属于脾、胃经的药物，分别为40及41味。药性方面:用药归属于清热药的最多，共计22味;其次为归属于补虚及活血化瘀类药物，两者均为16味。 (2)根据Apriori算法，共产生16919条规则，最常用的两种、三种及四种药物关联规则分别黄柏—金银花（高支持度）/蒲公英—金银花（高置信度）、黄柏+怀牛膝—苍术（高支持度）/苍术+怀牛膝—黄柏（高置信度）、黄柏+怀牛膝+金银花—苍术（高支持度）/苍术+怀牛膝+金银花—黄柏（高置信度）。 (3)聚类分析显示常用药对分别为:黄柏-苍术-薏苡仁、白芷-皂角刺、独活-秦艽-桑寄生。 (4)复杂网络分析示:内环的核心药物为金银花、白芷、川芎和生地黄。 2.体外实验研究 (1)临床PJI来源MRSA菌株的MLST分型为ST746。 (2)小檗碱对标准及临床PJI来源MRSA菌株的MIC均为500μg/mL，万古霉素对标准菌株的MIC为1μg/mL，对临床菌株的MIC为2μg/mL。小檗碱与万古霉素两药合用对MRSA呈无关作用。 (3)不同浓度的小檗碱溶液(MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC)在前6h表现出不同程度的抑制MRSA浮游菌的效果。 (4)小檗碱干预标准及临床MRSA菌株后结晶紫染色结果示:标准菌株:MIC组OD值与1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC、对照组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05），1/2MIC与1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC、对照组比较差异也均具有统计学意义（P＜0.05）;临床菌株:MIC组OD值与1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC、对照组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 (5)电镜下观察见对照组钛合金块表面粗糙不平，局部可见明显凹陷;MIC组见凹陷区较前减少，凹陷深度变浅，局部可见少量散在球形MRSA菌株;1/2MIC组、1/4MIC组及1/8MIC组见钛合金块表面以膜性物质覆盖，球形MRSA菌株明显增多;1/16MIC组、对照组见膜性物质覆盖更加稠密，且呈多层立体状生长，MRSA菌株凑集样生长更加明显。 (6)小檗碱对生长初期生物膜干预后，MIC组与1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、对照组活菌计数比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）;对成熟生物膜干预后，8MIC、4MIC、2MIC、MIC与对照组活菌计数比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。 (7)小檗碱浓度为MIC时，AgrA、RNAⅢ、Hlα、FnbpB、ClfA的基因表达均不明显，基因表达量分别为对照组的0％、7.2％、4.7％、0.7％、0％，与对照组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）;亚抑菌浓度时，AgrA、RNAⅢ、Hlα、FnbpB、ClfA的基因表达均受到明显抑制，基因表达量分别为对照组的43.5％、61.9％、21.8％、53.9％、26.2％，与对照组比较差异均具有统计学意义(P＜0.05);1/16MIC时，agrA、RNAⅢ、hlα、FnbpB、ClfA的基因表达受抑制已不明显，基因表达量分别为对照组的99.2％、97.2％、94.5％、95.8％、96.3％，与对照组比较差异均具无统计学意义(P≥0.05)。 3.动物实验研究 (1)一般情况观察:本实验中所有小鼠均无死亡，手术后7天内观察，对照组及实验组小鼠于术后3天后精神、进食次数基本正常，右后肢步态基本协调。PJI组小鼠精神不佳，进食次数减少，右后肢步态不协调，右后肢膝关节术口处见红肿，其中2只有窦道形成。 (2)Micro-CT结果显示:胫骨假体正、侧位均位于胫骨髓腔内，胫骨端突出于关节腔内，假体位置良好。 (3)血液分析结果显示:对照组、PJI组及实验组WBC计数分别为4.0×109/L、4.1×109/L及3.8×109/L，三组比较差异无统计学意义（P≥0.05）;对照组、PJI组及实验组NEUT％分别为20.3％、25.1％及27.4％，三组比较差异无统计学意义(P≥0.05)。 (4)假体周围组织细菌培养阳性率比较显示:PJI组及实验组分别为70.8％及37.5％，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。 (5)扫描电镜结果示:对照组假体镜下见表面光滑，无细菌附着;PJI组见大片状细菌附着区;实验组局部可见斑点状细菌附着区，但区域较PJI组明显缩小。 (6)病理结果示:对照组见肌细胞排列紧密，着色均匀，肌细胞间界限清晰。PJI组见小片状凝固性坏死，坏死灶内细胞核固缩、深染，肌浆蓝染嗜碱性改变。实验组与对照组基本类似，但肌束间血管及淋巴管周围可见少量炎性细胞浸润。 结论: 1.本院治疗PJI多以苦、寒及肝经之药为主，多以清热解毒、清热燥湿为法，随证加以补虚和/或活血化瘀类药物。 2.小檗碱对标准及PJI来源临床MRSA均具有抗菌、抗生物膜作用，且这一作用与抑制Agr二元调控及其介导的hlα有关，同时与抑制FnbpB及ClfA介导的细菌粘附作用有关。 3.小鼠PJI动物模型造模成功，小檗碱在小鼠PJI模型中能获得一定的疗效。
关节置换术;假体周围感染;小檗碱;数据挖掘
广州中医药大学
博士
中医骨伤科学
曾意荣
2022
中文
R687.4
2023-07-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）