骨碎补总黄酮对Masquelet技术治疗临界骨缺损的机制研究
目的: 1.比较外支架、钢板及髓内钉固定在Masquelet技术治疗胫骨临界骨缺损临床应用中的治疗效果，为胫骨感染性骨不连的临床治疗提供参考。 2.构建一种简便、重复性强的Masquelet技术重建大鼠股骨临界骨缺损实验动物模型，为之后展开Masquelet技术修复临界骨缺损的成骨机制研究，打下了坚实的基础。 3.基于Bmp-Smad信号通路中相关因子的表达，观察骨碎补总黄酮对Masquelet技术修复大鼠股骨临界骨缺损的影响。 方法: 1.三种不同固定方式在Masquelet技术治疗胫骨感染性骨缺损的对比研究 选取2011年9月至2022年1月广州中医药大学第一附属医院收治的胫骨感染性骨缺损患者，根据治疗方式的不同分为抗生素涂层髓内钉组（A组11例）钢板组(B组9例)、外固定组（C组7例）。收集分析患者基本资料，包括原始损伤、既往手术次数、培养出的细菌等，比较三组骨缺损长度、骨水泥旷置时间、并发症发生率、骨愈合时间、骨不愈合例数、感染复发例数、浅表感染例数、肢体功能评分等。 2.大鼠Masquelet技术实验模型的建立和评价 选用SPF级雄性SD大鼠共计20只，在右侧股骨中段截除了4mm骨组织，建立临界骨缺损区模型，应用金属接骨板内固定，在骨缺损区放置PMMA(Polymethylmethacrylate)的骨水泥旷置。4周之后将所有20只大鼠，予用麻醉后颈椎脱位处死，备皮、酒精消毒杀菌后取原入路，暴露出右侧股骨，观测右侧股骨大体外形，行影像学检测、从PMMA骨水泥旷置区切取诱导膜组织，观测诱导膜的组织形态学特征。 3.基于BMP-Smad信号通路探讨骨碎补总黄酮对Masquelet技术治疗临界骨缺损的作用机制研究 采用SPF级雄性SD大鼠，按照体重分层后随机划分为空白组、中药组、阻遏剂组、中药加阻遏剂组四个组，每一组分别有12只动物。动物造模采用第三章实验方法的手术步骤部分。补肾药物选取强骨胶囊（有效成份为骨碎补总黄酮）。中药组及中药加阻遏剂组给予骨碎补总黄酮灌胃、空白组及阻遏剂组，用等量生理盐水灌胃;阻遏剂组及中药加阻遏剂组腹腔注射LDN193189HC1，使用总量3mg/kg。于造模后第1天开始灌胃，至术后第4周取材当天，每天一次。各组选用12只大鼠获得诱导膜组织展开有关参考指标测试。通过X线检查观测金属接骨板、螺钉、PMMA骨水泥块，包括截骨端对位对线情况。应用HE染色观测各组诱导膜组织的形态学特征。通过免疫组化及western-blot检测各组诱导膜组织中Bmp-Smad信号通路有关蛋白BMP-2、BMP-4、Smad-1、BMPR1A的表达情况;通过q-PCR检测分析各组诱导膜组织中，以上影响因子的mRNA表达。 结果: 1.三种不同固定方式在Masquelet技术治疗胫骨感染性骨缺损的对比研究 A组患者清创后缺损长度为5.6±1.92cm，B组为5.9±1.96cm，C组5.8±1.79cm，三组组间比较，缺损长度没有显著差异(P＞0.05);A组下地时间为9.91±2.39周，骨愈合时间为20.09±4.64周，B组下地时间为17.83±7.06周，愈合时间为27.33±8.07周，C组下地时间为25.50±3.79周，骨愈合时间为33.00±3.16周。A组下地时间与B、C组比较显著缩短，比较差异有统计学意义(P＜0.05);B组下地时间与C组相比时间较短，差异也有统计学意义(P＜0.05)。A组骨折愈合时间较B，C组显著缩短，比较差异有统计学意义(P＜0.05);B，C组间骨折愈合时间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。术后LEFS下肢功能评分方面相比较，A组为73.64±4.20分，B组为64.22±6.36分，C组为59.71±5.22分，A组功能评分显著高于B、C两组，差异有统计学意义(P＜0.05)。从总体并发症看，A组11例患者1例出现并发症，发生率为9.1％;B组9例患者4例出现并发症，并发症发生率为44.4％;C组7例患者4例发生并发症，发生率为57.1％，A组并发症发生率与B、C两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);B、C两组间并发症发生率比较差异无统计学意义(P＞0.05)。从不同并发症分析，感染复发方面，A组1例患者感染复发，予重新清创旷置、改行Ilizarov技术治疗;B组1例因反复多次感染复发，最终行截肢手术;C组1例感染复发，后经多次清创旷置、外支架固定等治疗，骨折得到愈合，但骨感染仍然存在。A组感染复发率为9.1％，B组感染复发率为11.1％，C组感染复发率为14.3％。感染复发率方面，三个组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。A组所有11例患者均获得骨愈合。愈合率为100％;B组2例患者骨不愈合，C组2例患者骨不愈合，A组骨不愈合比例虽然明显少于B，C组，但三组比较差异无统计学意义(P＞0.05);A组没有患者出现浅表软组织感染，B组1例，C组浅表感染例数最多，为2例，C组术后浅表感染比较较高，为28.6％，但三组相比，差异比较无统计学意义。 2.大鼠Masquelet技术实验模型的建立和评价 20只大鼠都没有发生因麻醉或者灌胃等因素造成死亡的不良事件，手术之后1只大鼠因撕咬伤口缝线，导致伤口持续渗液、红肿，发生伤口感染。另有一只大鼠术后逐渐出现患肢畸形，术后4周行X线检查时发现远端螺钉松脱，骨水泥块移位，造模失败（后重新补齐），剩余18只测试实验大鼠接骨板固定良好，内固定未发生断裂、滑脱等现象。内固定成功比例90％，大鼠术后一般情况良好，没有出现显著感染征象。诱导膜组织HE染色结果显示:内层组织含大量的的新生血管组织，外层是成纤维组织细胞和胶原组织;诱导膜组织中存在大量炎症细胞浸润;炎症细胞主要聚集在诱导膜近骨水泥一边。 3.基于BMP-Smad信号通路探讨骨碎补总黄酮对Masquelet技术治疗临界骨缺损的作用机制研究 造模之后4周，从各组X线检测结果看，接骨板、螺丝钉及PMMA骨水泥的位置均固定在位，无松动或者移位发生。免疫组化结果显示中药组诱导膜组织中BMP-2、BMP-4、Smad-1、BMPR1A的阳性表达较其他三组明显增强。诱导膜组织的westernblot检测结果证明和其他各组对比，中药组蛋白表达量与其他三组比较均有增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与中药加阻遏剂组相比，空白组诱导膜组织中的BMP-2、BMP-4、BMPR1A和Smad1的蛋白表达量更高(P＜0.05);与其他各组相比，阻遏剂组各因子的蛋白表达量最低(P＜0.05)。q-PCR检测结果可知和其他各组对比，中药组中Bmp-Smad信号通路中BMP-2、BMP-4、BMPR1A和Smad1的基因表达明显上升(P＜0.05)。阻遏剂组Bmp-Smad信号通路有关因子的基因表达均明显下调(P＜0.05)。 结论: 1.Masquelet技术治疗周期短，患者舒适度高，患者更能配合治疗，可以有效解决胫骨感染性骨缺损的问题，相比钢板和外支架固定，带抗生素涂层髓内钉固定再手术率更低，骨愈合时间更短，完全负重时间更早，可推荐作为Masquelet技术治疗胫骨感染性骨缺损的首选固定方式。 2.本次Masquelet实验模型具备可重复性高、易操作、实验费用少等优势，为本次实验的后续研究打下了坚实的基础，也为Masquelet技术的基础实验研究，提供了比较可靠的模型。 3.骨碎补总黄酮可通过上调Bmp-Smad信号通路上各因子的表达，来促进Masquelet技术中诱导膜成骨能力的提高及新生骨组织产生，进而对临界骨缺损修复具有良好的推动作用。
骨缺损;临界骨缺损;信号通路;骨碎补总黄酮;诱导膜
广州中医药大学
博士
中医骨伤科学
黄枫
2022
中文
R687.3
2023-07-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）