肉豆蔻酸下调NF--κB/NLRP3轴抑制破骨分化抗骨质疏松的实验研究
目的: 1.在体内实验中，明确肉豆蔻酸(myristicacid，MA)调控NLRP3炎症小体释放抗骨质疏松(osteoporosis，OP)的作用; 2.在体外实验中，探讨MA下调NF-κB/NLRP3轴抑制破骨分化抗OP的作用机制。 方法: 1.动物实验研究 (1)MA对OP小鼠的治疗作用 48只2月龄的野生型C57BL/6(B6)小鼠按照性别分为两组（雄性24只，雌性24只），每组均随机分为三个亚组:对照组（CON组）、模型组（OP组）、肉豆蔻酸治疗组（MA组），每组8只。所有小鼠适应性饲养一周。CON组小鼠不作干预，给予充足的维持饲料及水，3月龄时取材。剩余小鼠饲养在SPF环境下至22月龄，获得自然衰老的OP小鼠模型后，MA组和OP组分别予以药物和等量溶剂干预2个月后取材。检测指标: ①分离小鼠股骨，用Micro-CT进行骨微细结构扫描，划定感兴趣区域，进行三维重建，获取相关参数; ②将小鼠股骨用甲醛固定后，进行脱钙、脱水、包埋、切片处理，进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistantacidphosphatase，TRAP)染色，观察股骨骨小梁表面破骨细胞分化及活性情况。 (2)MA对NLRP3炎症小体的作用 分离出(1)中OP组和MA组的股骨，利用免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）检测NLRP3阳性细胞的数量。 2.细胞实验研究 (1)MA对小鼠骨髓源性巨噬细胞（bonemarrow-derivedmacrophages，BMMs）增殖的影响 从小鼠股骨和胫骨的髓腔内提取BMMs，在巨噬细胞集落刺激因子(macrophagecolonystimulatingfactor，M-CSF)和核因子κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)受体活化因子配体(receptoractivatorofnuclearfactorκBligand，RANKL)的共同刺激下，诱导其分化为具有骨吸收能力的成熟破骨细胞。CCK8法检测不同浓度(0μM、10μM、50μM、100μM、150μM、200μM)MA在0、24、48、72小时对BMMs增殖的影响，筛选安全给药浓度。 (2)MA对BMMs破骨分化的作用 ①TRAP染色检测MA对BMMs破骨分化的影响; ②羟基磷灰石涂层骨吸收实验检测MA对破骨细胞骨吸收功能的影响。 (3)MA调控NF-κB和MAPK信号通路对破骨分化的作用 ①将(1)中诱导后的破骨细胞分为CON组和MA组，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测破骨细胞的特异性基因Nfatc1、Ctsk在两组中的相对表达情况; ②蛋白组学免疫印迹法(Westernblot)检测破骨细胞相关标志蛋白CTSK、TNF-α在上述两组中的表达; ③Westernblot检测NF-κB和MAPK信号通路相关关键蛋白p50、p-p50、p38、p-p38、JNK、p-JNK在上述两组中的表达。 (4)NF-κB和NLRP3的调控关系 ①用NLRP3抑制剂MCC950干预RANKL诱导后的破骨细胞，TRAP染色和羟基磷灰石涂层骨吸收实验验证MCC950在BMMs中对NLRP3的作用; ②Westernblot检测在0、2、4、6天使用MCC950干预后的破骨细胞中NLRP3、p38、p-p38、p50和p-p50的蛋白表达; ③Westernblot检测在NF-κB激动剂脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和NF-κB抑制剂JSH-23干预的破骨细胞中NLRP3、p50、p-p50的蛋白表达; ④Westernblot检测在p38MAPK激动剂积雪草酸(asiaticacid，AA)和p38MAPK抑制剂SB203580干预后的破骨细胞中NLRP3、p38、p-p38的蛋白表达。 (5)MA与NLRP3的亲和性检测 对MA和NLRP3进行分子对接，检测两者之间的结合能力。 (6)MA对NF-κB/NLRP3轴的调控作用 ①TRAP染色检测MA、LPS和JSH-23对破骨细胞分化的作用; ②羟基磷灰石涂层骨吸收实验检测MA、LPS和JSH-23对破骨细胞骨吸收功能的作用; ③Westernblot检测MA、LPS、JSH-23干预破骨细胞前后NLRP3、p50、p-p50、IL-1β、pro-IL-1β的蛋白表达。 结果: 1.动物实验研究 (1)MA对OP小鼠的治疗作用 ①MA可以有效改善OP小鼠的骨微细结构破坏 ②MA可以抑制OP小鼠破骨细胞分化 (2)MA可以减少NLRP3炎症小体的释放 2.细胞实验研究 (1)MA浓度≤100μM时，在72小时内对BMMs没有细胞毒性，对BMMs增殖没有影响;在24小时，150μM浓度的MA可显著抑制BMMs增殖(P＜0.001);在24、48、72小时，150μM、200μM浓度的MA可显著抑制BMMs增殖（P＜0.01）。 (2)MA可呈浓度依赖性地抑制破骨细胞分化和骨吸收 (3)MA阻断NF-κB和MAPK/p38信号通路抑制破骨分化 (4)NF-κB是NLRP3的上游调控蛋白 (5)MA与NLRP3具有良好的亲和性 (6)MA下调NF-κB/NLRP3轴抑制破骨分化 结论: 从体内实验研究发现:MA可以有效改善OP小鼠模型骨微细结构损害，并且显著抑制NLRP3炎症小体的激活。从体外实验研究发现:NF-κB是NLRP3炎症小体的上游调控蛋白，MA通过下调NF-κB/NLRP3轴抑制破骨分化，且MA与NLRP3具有良好的亲和性。因此，MA可通过下调NF-κB/NLRP3轴抑制破骨分化抗OP。
骨质疏松;肉豆蔻酸;炎症小体;破骨分化
广州中医药大学
博士
中医骨伤科学
梁德
2022
中文
R681.1
2023-07-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）