泽兰防治KOA的网络药理学分析以及对KOA模型AQP、MMP3、IL--17影响的研究
目的: 运用网络药理学的研究方法，构建中药泽兰-活性成分-作用靶点-疾病网络图，从而找到泽兰防治膝骨关节炎的潜在作用靶点，进一步阐释泽兰干预膝骨关节炎的作用机制。 通过研究泽兰对实验性家SD大鼠膝骨关节炎(KOA)中水通道蛋白AQP1、AQP3、AQP9和肿瘤坏死因子(TNF-α)、MMP3、IL-17的表达，来初步探讨泽兰早期防治KOA发生的机制，从而寻找KOA的治疗靶点，为“血不利则为水”提供数据支撑和KOA的中医药防治提供可靠的理论依据。 方法: 实验一:通过查询TCMSP数据库对泽兰可能的生物活性成分及作用靶点的筛查和预测;通过检索Genecards和OMIM获取疾病的相关作用靶点;通过Uniprot数据库查询蛋白，利用String构建蛋白相互作用的PPI网络，利用Cytoscape软件构建“泽兰-成分-靶点-疾病”相互作用网络，利用Funrich工具进行GO富集分析和利用R语言进行KEGG富集分析。 实验二:1.8周龄SPF级雄性SD大鼠90只，体重平均220-250g，按照体重不同，采用随机区组设计法分为假手术组（A组），模型组（B组）、实验组泽兰低剂量组(C)、实验组泽兰中剂量组(D)、实验组泽兰高剂量组(E)，每小组各18只。 2.造模方法:(1)假手术组—动物麻醉后只做切开皮肤及膝关节囊暴露膝关节腔后，逐层缝合关闭;(2)模型组—双侧膝关节内侧切口，剪断前交叉韧带及内侧副韧带，部分切除内侧半月板前角，行前抽屉试验、膝关节伸直外翻应力试验确认韧带已切断后，逐层缝合关闭膝关节腔;每天驱赶运动2小时;(3)实验组—外科手术造模成功后，从造模后第一天开始给予不同的量泽兰灌胃，每天灌胃1次，连续灌胃至试验结束，处死动物，进行检验。 3.从造模开始的第1天开始灌胃，疗程时间为6周，灌胃情况如下:A组每日给予与用药组等容积的生理盐水灌胃;B组每日给予用药组等容积的生理盐水灌胃;C组每日给予以相当于临床成人剂量倍1/2倍的泽兰;D组每日给予相当于临床成人剂量的泽兰灌胃;E组每日给予相当于临床成人剂量2倍的泽兰灌胃。 4.分别于2周、4周、6周从各组中各随机取6只，脊柱脱臼法处死，测定左侧膝关节滑膜组织中AQP1、AQP3、AQP9、MMF3、TNF-α、IL-17各组试验指标。 5.组织形态学观察:大体肉眼观察关节内情况，Mankin法对左侧股骨内侧髁关节软骨进行评价，并根据评分结果判定大鼠膝骨关节炎的病变程度。 6.关节水肿指数的测定采用足部容积法根据其与模型组之间的病变程度来评价，0分:肿胀度≤5％;1分:肿胀度≤15％;2分:15％＜肿胀度＜30％;3分:30％＜严重肿胀度＜60％;4分:肿胀度＞60％。 7.统计学分析:统计学处理使用统计软件SPSS25.0分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差((x)±s)表示，不符合正态分布的采用中位数（四分位数）表示。采用Shapiro-Wilk检验对数据进行正态性检验，对于符合正态分布而且符合方差齐性的，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验;对不符合正态分布的则采用非参数检验的Kruskal-Wallis检验，组间两两比较采用Kruskal-Wallis单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计意义。 结果: 实验一:从TCMSP进行筛选并根据文献共获得了泽兰13个有效成分，同时预测出55个作用靶点，通过相关数据库共获得OA的靶点2227个，GO富集显示，泽兰调控OA关键靶点主要涉及细胞周期、炎症、感染、癌症相关等55条信号通路。 实验二:1.各时间点假手术组SD大鼠膝关节软骨的外观基本正常，具体表现为:色泽红润明亮、表面光滑、无裂纹及软化及无增生迹象。模型组和泽兰低、中、高剂量组:均表现不同程度的关节退变，且模型组的退变程度比泽兰低、中、高剂量组更为严重。 2.软骨大体观察结果:假手术组造模后软骨无明显改变，模型组2周、4周、6周时软骨大体观察明显改变，软骨退变程度增加;泽兰低、中、高剂量组与模型组相比，软骨的退变程度减轻。 3.软骨的Mankin评分结果:模型组2周、4周、6周软骨形态改变明显，随着时间进展，Mankin评分逐渐增高。泽兰中剂量组2周时Mankin评分低于模型组（P＜0.05）;泽兰高级剂量组在6周时Mankin评分低于模型组(P＜0.05)。 4.模型组的AQP1、AQP3、AQP9的测量结果在2周、4周、6周时均高于假手术组(P＜0.05)，泽兰低、中、高剂量组的AQP1、AQP3、AQP9的测量结果在2周、4周、6周均低于模型组(P＜0.05)，差异具有统计学意义。 5.模型组的MMP3的测量结果在2周、4周、6周时均高于假手术组(P＜0.05)，泽兰低、中、高剂量组的MMP3的测量结果在2周、4周、6周均低于模型组（P＜0.05），差异具有统计学意义。 6.模型组的TNF-α的测量结果在2周、4周、6周时均高于假手术组（P＜0.05），泽兰低、中、高剂量组的TNF-α的测量结果在2周、4周、6周均低于模型组（P＜0.05），差异具有统计学意义。 7.模型组的IL-17的测量结果在2周、4周、6周时均高于假手术组P＜0.05)，泽兰低、中、高剂量组的IL-17的测量结果在2周、4周、6周均低于模型组(P＜0.05)，差异具有统计学意义; 8.关节水肿指数:模型组与假手术组相比，2周、4周、6周不同时间点上，模型组的关节水肿指数高于假手术组(P＜0.05)，2周、6周时与模型组泽兰高剂量组的关节水肿指数低于模型组(P＜0.05)。 结论: 泽兰治疗膝骨关节炎具有多成分、多靶点的特点;可能通过P53信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路起到治疗作用，与当前主流的治疗OA的作用机制相吻合。 泽兰能够降低KOA模型大鼠滑膜组织中的AQP1、AQP3、AQP9、IL-17、MMP3、TNF-α的含量，改善大鼠膝骨关节炎滑膜组织的炎症，可以延缓软骨退变，从而起到改善关节功能。
泽兰;膝骨关节炎;网络药理学;细胞因子
广州中医药大学
博士
中医骨伤科学
方坚
2019
中文
R684.3;R285
2023-07-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）