AMPK/mTOR信号通路介导壮骨止痛胶囊对绝经后骨质疏松症细胞自噬调节作用机制研究
目的: 1.观察壮骨止痛胶囊治疗绝经后骨质疏松症的临床疗效。根据临床病例数据分析结果与自噬调节因子mTORC1线性相关分析结果进行整合分析，探索绝经后骨质疏松症与AMPK/mTOR信号通路介导的细胞自噬间的相关性。 2.采用去势建立绝经后骨质疏松症大鼠模型，明确壮骨止痛胶囊对去势大鼠的干预作用，进一步分析动物实验结果与临床研究结果是否具有一致性。 3.明确AMPK/mTOR信号通路介导壮骨止痛胶囊对绝经后骨质疏松症细胞自噬的调控作用及可能的分子机制。 方法: 1.临床研究 (1)研究对象、分组及药物治疗:2021年01月至2022年06月期间，于广西壮族自治区柳州市中医医院骨伤科门诊和住院部筛选符合纳入标准的绝经后骨质疏松症（肝肾阴虚、气滞血瘀型）患者70例，序贯、随机平均分为壮骨止痛胶囊组和阿仑瞵酸钠组两组。所有纳入的患者在给予口服钙剂和维生素D的基础治疗上，壮骨止痛胶囊组给予口服壮骨止痛胶囊4粒/次，3次/日进行治疗，阿仑膦酸钠组给予口服阿仑膦酸钠70mg/次，1次/周进行治疗。每4周一个疗程，共6个疗程。 (2)临床观察指标: ①骨密度:采用双能X线骨密度检测仪检测两组患者治疗前后腰椎骨密度值。 ②中医证候积分:根据中医证候量化分级评分表对临床症状表现进行分级量化评分，记录并比较两组治疗前后积分变化。 ③血清Ca2+、E2、IL-6和TNF-α:采用荧光定量PCR方法检测两组患者治疗前后血清Ca2+、E2水平;采用酶联免疫吸附法（EILSA法）测定血清IL-6、TNF-α水平。 ④血清骨转换标志物:采用EILSA法检测两组患者治疗前后骨转换标志物含量，包括:骨碱性磷酸酶、甲状旁腺素、骨钙素、Ⅰ型前胶原氨基末端前肽、β胶联降解产物和25-羟基维生素D含量。 ⑤mTORC1含量:采用EILSA法测定两组患者治疗前后血清mTORC1含量，记录并将其与相关临床疗效数据进行线性相关分析，探索自噬调节因子mTORC1与绝经后骨质疏松症间的相关性。 2.动物研究 (1)实验动物、造模、分组及药物干预:采用60只SPF级健康雌性6月龄SD大鼠，采用双侧卵巢切除术去势建立绝经后骨质疏松症大鼠模型。根据体重，利用Excel表Rand函数进行随机平均分为2组，正常对照组18只和去势手术组42只，3个月后2组各随机取出6只取材验证造模是否成功，验证造模成功后将剩余去势组大鼠随机平均分为3组。所有大鼠共分为4组:正常对照组、去势组、壮骨止痛胶囊组和雌激素组，每组大鼠12只。造模成功后开始每天分别给予各组大鼠相应药物干预。正常对照组和去势组大鼠每天给予10ml/kg生理盐水灌胃，壮骨止痛胶囊组给予0.56g/kg壮骨止痛胶囊灌胃1次/日;雌激素组每天给予复方雌二醇片0.104mg/kg灌胃1次/日，连续给药3个月。药物干预3个月结束后取材进行相关指标检测。 (2)检测指标: ①骨密度:采用双能X线骨密度检测仪检测药物干预前后各组大鼠全身及腰椎骨密度值。 ②Micro-CT:采用Micro-CT对大鼠离体腰3椎体骨组织参数进行扫描分析，并获得腰椎横断面切面图进行骨组织微细结构学观察分析。 ③组织形态学:分别选取大鼠腰2椎体进行TRAP染色、腰3椎体进行HE染色以观察分析组织形态学变化。 ④血清骨转换标志物、炎症相关因子、钙离子浓度:采用EILSA法检测大鼠骨转换标志物(PINP、BALP、β-CTX)、血清炎症因子（TNF-α、IL-17、IL-1β）、血清钙离子浓度的影响。 ⑤AMPK/mTOR信号通路上下游自噬相关基因表达及蛋白水平:采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)、免疫印迹法（WesternBlotting）分别检测腰椎骨组织中AMPK/mTOR信号通路上下游自噬相关因子AMPK、mTOR、LC3-Ⅱ、Atg5、Beclin-1、ULK1水平。 结果: 1.临床研究结果 (1)骨密度:壮骨止痛胶囊可显著提升腰椎骨密度值，治疗前后腰椎骨密度差值比较提示阿仑膦酸钠组效果更为明显。 (2)中医证候积分:壮骨止痛胶囊能显著降低中医证候积分，治疗前后中医证候积分差值比较显著优于阿仑膦酸钠组。 (3)腰部疼痛VAS评分:壮骨止痛胶囊可显著降低腰背部疼痛VAS评分，但改善效果不如阿仑膦酸钠明显。 (4)血清Ca2+、E2、IL-6和TNF-α水平:壮骨止痛胶囊能够显著提升血清Ca2+、E2水平，显著降低IL-6、TNF-α水平，壮骨止痛胶囊提升E2水平显著优于阿仑膦酸钠。 (5)骨转换标志物水平:壮骨止痛胶囊能显著提升骨形成相关指标(BALP、PTH、OC、PINP)水平，对于BALP、PTH、OC的差值与阿仑膦酸钠组比较无统计学差异，而对于PINP的差值比较阿仑膦酸钠组优于壮骨止痛胶囊组。壮骨止痛胶囊组能显著提升骨吸收指标(β-CTX)水平，治疗前后β-CTX差值比较不如阿仑膦酸钠组显著。另外，壮骨止痛胶囊可显著提高25-OH-VD水平，与阿仑瞵酸钠比较无统计学差异。 (6)mTORC1含量及其与临床信息的相关性分析:壮骨止痛胶囊可显著降低血清中mTORC1含量，mTORC1含量与BMD之间存在显著负相关性，而与25-OH-VD之间无显著相关性。 2.动物实验结果 (1)骨密度:去势可显著降低大鼠骨密度，壮骨止痛胶囊可显著提高去势大鼠腰椎骨密度，而对全身骨密度无显著性改变。 (2)Micro-CT:壮骨止痛胶囊可显著提高去势大鼠腰椎骨表面密度(BS/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)。横切面图显示:壮骨止痛胶囊可增加去势大鼠骨小梁数量，骨小梁排列更为紧密，且整齐均匀有序。 (3)组织形态学评估:TRAP染色:去势可增加大鼠松质骨单位面积破骨细胞数，壮骨止痛胶囊可使去势大鼠腰椎骨组织内破骨细胞染色变深，破骨细胞数量变少。HE染色:壮骨止痛胶囊可显著提升去势大鼠腰椎椎体骨髓腔内骨小梁数量，使其脂肪细胞数量显著减少，骨小梁表面成骨细胞显著增加，破骨细胞显著减少，骨小梁相对较厚实，骨小梁间隙变窄，连接较多且保持连续。 (4)骨转换标志物含量:去势可引起大鼠血清PINP和BALP水平显著降低，β-CTX水平明显增加，雌激素具有显著降低β-CTX的作用，壮骨止痛胶囊与雌激素组比较无统计学差异，表明壮骨止痛胶囊具有一定降低β-CTX的作用趋势。 (5)血清钙离子浓度:去势可引起大鼠血清钙离子浓度有下降趋势，壮骨止痛胶囊具有一定提高去势大鼠钙离子浓度趋势。 (6)血清TNF-α、IL-17、IL-1β含量:去势可引起大鼠血清IL-17和IL-1β含量均显著上升，壮骨止痛胶囊可显著降低去势大鼠血清IL-17和IL-1β含量，而对血清TNF-α无显著作用。 (7)mTOR/AMPK信号通路相关基因表达水平:去势可引起大鼠ULK1、Beclin-1、Atg5、AMPK、LC3-ⅡmRNA表达均显著下降，mTORmRNA表达显著上升，壮骨止痛胶囊可显著上调去势大鼠ULK1、Beclin-1、Atg5、AMPK、LC3-ⅡmRNA表达，下调其mTORmRNA表达。 (8)mTOR/AMPK信号通路相关蛋白水平:去势可引起大鼠ULK1、Beclin-1、Atg5、AMPK、LC3-Ⅱ蛋白水平均显著下降，mTOR蛋白水平显著提高，壮骨止痛胶囊可显著降低去势大鼠ULK1、Beclin-1、Atg5、AMPK、LC3-Ⅱ蛋白水平，显著提高其mTOR蛋白水平。 结论: 1.壮骨止痛胶囊联合钙剂和维生素D能够有效调节骨代谢，增加骨密度，同时具有良好的改善中医临床证候的作用。mTOR为中心的信号通路介导的自噬与绝经后骨质疏松症之间的存在显著负相关性。 2.去势可引起骨形成减少和骨吸收增加，引起骨代谢不平衡，导致骨小梁减少变疏，导致骨量丢失。壮骨止痛胶囊可恢复去势所诱导的上述骨细胞分化的改变，有效减轻去势诱导的骨丢失和骨小梁的异常变化，在去势诱导绝经后骨质疏松症中具有骨保护作用，其抗骨质疏松的作用与临床研究结果基本一致。 3.去势可诱发AMPK/mTOR信号通路上下游相关自噬因子的活化，壮骨止痛胶囊可通过改变上述相关因子的变化，从而调控细胞自噬，减弱去势对成骨细胞和破骨细胞的负面影响，恢复骨密度和骨微结构特性。同时，壮骨止痛胶囊还具有一定抑制炎症因子的释放，从而达到缓解骨质疏松性疼痛的疗效。
绝经;骨质疏松症;信号通路;壮骨止痛胶囊
广州中医药大学
博士
中医骨伤科学
黄宏兴
2022
中文
R271.116
2023-07-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）