健脾补气法治疗重症肌无力的疗效评价及黄芪甲苷干预EAMG的菌群--免疫机制研究
目的 重症肌无力(Myastheniagravis，MG)是一种神经免疫罕见病，国医大师邓铁涛教授认为，脾胃虚损是MG（痿病）的主要病机，健脾补气法是主要的治疗方法。研究发现，MG患者的肠道微生物组成与健康人存在显著差异，某些菌群及代谢物的改变一定程度上与免疫细胞水平相关并导致MG发病。此外MG患者的肠道关键微生物特征在实验性自身免疫性重症肌无力(ExperimentalAutoimmuneMyastheniaGravis，EAMG)小鼠动物模型中保持不变。本研究先从MG严重程度评分及西药使用率方面对健脾补气法治疗MG进行临床疗效评价，并检测健脾补气法干预前后的外周血细胞因子表达水平。基于菌群宏基因测序技术，应用黄芪甲苷(AstragalosideⅣ，AS-Ⅳ)干预治疗EAMG进行实验研究，从肠道菌群-免疫调节角度探讨中医药治疗MG的作用机制。 方法 1.采用观察性队列研究，通过收集中药组及对照组MG患者流行病学特征、治疗前后临床结局评分及西药使用率改变方面，对健脾补气法治疗的疗效进行比较分析，以评价健脾补气法治疗MG的临床疗效优势。通过检测治疗前后的免疫因子改变趋势评价健脾补气法的作用机制。 2.通过建立EAMG小鼠动物模型，通过小鼠体重、临床症状评分以评估造模是否成功，采用健脾补气法中的君药黄芪的主要成分AS-Ⅳ进行干预，测量治疗前后的肌力，收集治疗前后血清样品及粪便样品，通过抗体滴度水平及抓力评估AS-Ⅳ治疗EAMG的疗效。流式细胞技术检测干预后小鼠脾脏及胸腺T淋巴细胞比例，ELISA法检测外周血清细胞因子水平，探讨AS-Ⅳ治疗EAMG的免疫调节机制。 3.运用宏基因组测序的方法检测各组小鼠肠道粪便样品的全基因组序列，通过基因数据质量质控、基因组装及物种注释，构建非冗集基因库。对样品数量及物种丰度进行抽样评估，评估样品采样物质丰富度，检测其样品量及基因测序深度是否合理。 4.通过生物信息学方法分析它们不同组量样品的菌群差异及基因功能特征，并对差异菌群进行诊断模型预测，以评估差异菌群对EAMG的诊断价值，分析AS-Ⅳ治疗EAMG的靶向差异菌株的调控及代谢通路，进一步探讨健脾补气法治疗MG的菌群靶向机制。 结果 1.健脾补气法治疗MG的临床疗效及免疫因子改变 (1)通过比较中药组及对照组的用药前后情况，健脾补气法的中药组糖皮质激素类用药的比例从54.35％降低至32.61％，对照组从30.77％升高至61.54％，治疗后的比较差异有统计学意义(P＜0.05)，其他西药治疗后的数据比较差异无统计学意义。 (2)中药组及对照组治疗前后评分的差值对比，两组患者评分均有下降，QMG、MGC、MG-QOL评分两组比较均无统计学意义(P＞0.05)，说明两组治疗疗效相当。但ADL评分两组比较有统计学意义，纳入相关影响因素进行多因素回归分析，采用多因素回归分析，发现数值变化仍然只有ADL差异有统计学意义，调整不同变量之后趋势及统计结果均不变。 (3)对健脾补气法治疗前后的血清样本进行免疫因子表达水平检测，结果显示健脾补气法治疗后IFN-γ、IL-4有下降趋势，TGF-β呈上升趋势。但统计结果显示仅TGF-β的变化有统计学意义(P＜0.05)。 2.主动免疫法造模后，症状评分方面EAMG组小鼠评分明显高于空白组，抗体滴度EAMG组明显高于空白组，说明EAMG造模方法成功有效。应用AS-Ⅳ干预EAMG小鼠治疗后，抗体滴度水平下降、临床肌无力症状得到好转，统计分析差异有统计学意义(P＜0.05)。AS-Ⅳ改善EAMG肌无力症状的疗效明显。 3.AS-Ⅳ干预EAMG后检测外周血清细胞因子表达水平，发现干预后EAMG体内的IFN-γ、IL-17降低，TGF-β表达水平升高。流式细胞技术检测各组小鼠胸腺CD4+IFN-γ+Th1细胞和CD4+IL-17A+Th17细胞比例，脾脏中的CD4+IFN-γ+Th1、CD4+IL-17A+Th17及CD4+FOXP3+Treg细胞的比例结果发现:造模后Th1、Th17比例升高而Treg细胞比例下降，AS-Ⅳ干预后比例明显恢复，差异均有统计学意义(P＜0.05)。说明AS-Ⅳ干预EAMG小鼠可显著恢复体内T淋巴细胞的比例失衡。 4.通过宏基因测序构建了三组小鼠肠道粪便样品的高质量基因序列，对基因序列进行组装及物种注释后，获得基因集及不同层类的物种丰度表。然后进行稀释曲线分析。结果显示随着样本数量增加，各组所涵盖的基因数据也明显增加，稀释曲线上升趋势明显，说明样品采样合理测序深度足够。 5.根据属水平的三组样品物种多样性分析结果显示，空白组的物种Alpha多样性Shannon指数高于造模组，干预组后再次升高，Simpson指数显示健康组高于造模组，干预组后再次升高，两组比较差异均有统计学意义。说明AS-Ⅳ干预可明显改变EAMG的肠道菌群多样性。 6.在微生物种水平上，比较三组样品的具体菌株差异，厚壁菌门的Roseburiaintestinalis、Enteroclosterclostridioformis菌以及拟杆菌门的hocaeicolavulgatus菌在EAMG组中丰度增加，AS-Ⅳ干预后又明显下降。 7.KEGG基因富集分析表明，细菌磷酸转移酶系统(BacterialPhosphotransferaseSystem，PTS)和双组分系统(Two-componentsystem，TSC)可能是其主要的调控通路。基于空白对照组与EAMG组差异前30的标志菌群的相对丰度，将数据分割成训练集和测试集以构建诊断预测模型，通过AUC值来验证结果表明AUC面积值可以达到0.938。 结论 1.健脾补气法治疗MG可改变体内细胞因子的表达水平，其疗效优势在于减少激素的使用率。 2.通过AS-Ⅳ治疗可有效改善EAMG小鼠的肌力症状并降低抗体滴度水平，其作用可能是通过调节EAMG的免疫细胞及相关因子水平而达到治疗的作用。 3.AS-Ⅳ干预EAMG的肠道菌群的物种多样性明显升高，其具体差异菌株可能是Roseburiaintestinalis等三类靶向菌株。相关基因代谢调控通路可能是PTS及TSC系统。诊断预测模型验证标志性菌株可有效区别健康小鼠及EAMG小鼠。 4.AS-Ⅳ治疗EAMG的作用机制可能是通过调节体内肠道微生物群、改善免疫失衡反应、纠正免疫紊乱而起到改善肌无力症状的疗效。
重症肌无力;疗效评价;健脾补气法;免疫调节
广州中医药大学
博士
中医内科学
刘凤斌
2022
中文
R746.1;R242
2023-07-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）