白蜡合成关键酶FAR3基因克隆、表达与初步生化特性分析
白蜡主要是由定杆期的白蜡虫Ericeruspela二龄雄虫分泌，是一种天然超长链单酯，被广泛应用在食品、化工、医药以及化妆品或精密仪器等领域。蜡酯的生物合成途径在动植物中保守，主要由脂酰辅酶A还原酶(fattyacyl-CoAreductase，FAR)与蜡酯合酶(waxsynthase，WS)催化生成。由于生物体中存在多个FAR，其生理功能各不相同，需对FAR的蛋白表达、生化特性等进行研究，才能明确该酶参与蜡酯合成的机理。本研究通过三代全长转录组测序筛选获得与白蜡合成相关的far基因，针对其中的一个far基因进行了cDNA克隆和序列分析、原核表达、抗体制备、在雌雄虫中蛋白表达分析以及生化特征分析等研究，结果表明，获得的该FAR3蛋白在白蜡虫二龄雄虫中表达量非常高，远高于雌虫，初步的生化特性分析表明，该酶的最适温度与白蜡生产中的环境温度比较一致，最适底物与白蜡的主要成分一致。主要研究结果如下: (1)对白蜡虫泌蜡初期的二龄雄虫成功进行了转录组测序，共获得81个far基因，筛选获得与白蜡虫泌蜡一致的6个基因，其中本研究关注的一基因命名为far3。 (2)成功获得了far3cDNA全长以及ORF;经序列分析，FAR3具有FARC超级家族的保守结构;系统发育分析，FAR3与人类、小鼠和果蝇等参与蜡酯合成的FAR聚为一支，初步说明白蜡虫FAR3可能在白蜡合成中起作用。 (3)FAR3原核表达载体pET-30a-eGFP/EpelFAR3成功构建，诱导表达获得大量FAR3目的蛋白，对该蛋白进行体外酶活分析，发现通过此途径表达的FAR3蛋白不具有生物活性。 (4)利用原核诱导表达的FAR3蛋白成功制备了FAR3的单克隆抗体，通过单克隆抗体分析了FAR3在白蜡虫雌雄虫中的表达情况，证实FAR3在二龄雄虫中大量表达，在雌虫中有微量表达。 (5)构建FAR3真核表达载体pIZ/V5-FAR3-Linker-eGFP转入BmN家蚕细胞并成功表达，筛选获得稳定表达FAR3的细胞系。 (6)利用家蚕细胞表达获得FAR3蛋白，通过体外酶活反应进行了FAR3生化特征的初步探究，确定了家蚕细胞表达的FAR3蛋白具有生物活性，明确FAR3可催化C28脂酰辅酶A还原为C28脂肪醇，体外酶活反应的最佳pH值为3.0，最适反应温度为35℃，与泌蜡特点一致。 本研究初步确定了FAR3是参与白蜡合成的，为白蜡虫其他FAR的研究提供了参考，对于白蜡虫分泌白蜡生化机理的研究具有重要意义。
白蜡虫;脂酰辅酶A还原酶;单克隆抗体;酶活分析;生化特性
中国林业科学研究院
硕士
生物化学与分子生物学
杨璞
2019
中文
S899.1
2023-07-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）