家畜新型转基因载体的构建及功能评价
转基因技术作为一项科学创新，在多种家畜中获得成功并得到初步应用，但仍然存在一系列限制转基因动物规模化生产与相关产品研究开发的问题。特别是成本高、敲除效率低、整合效率低及转基因表达水平低的矛盾尤为突出。外源DNA导入受体细胞后可能随机地插入受体基因组中的任意位置，因而存在有效整合、沉默整合和毒性整合等不同的整合状态，其表达水平也不均一。CRISPR/Cas9系统近年来被广泛的应用于基因编辑，渐渐成为转基因技术中的常规操作技术。可针对不同基因设计相应的sgRNA靶位点进行编辑。然而，在细胞中对多个基因同时进行编辑仍然具有困难。 为了构建高效新型哺乳动物转基因载体，实现目的基因的高效表达，以及改进更行之有效的基因编辑工具，本研究进行了以下试验: 1.猪MAR序列调控PiggyBac系统在HEK293T中的转基因表达作用初探 为了检测新发现的猪MAR序列(SusscrofaMAR，SusMAR)在外源基因表达中的作用效果，本试验以PiggyBac(PB)载体为骨架，构建了MAR在不同位置的三种重组载体，并以牛的MAR序列(BostaurusMAR，BosMAR)为阳性对照。将这些重组载体与PB转座酶（PBase+组）或PB转座酶对照质粒（PBase-组）共转染HEK293T细胞。无抗生素培养16天后，以β-gal检测试剂盒测定蛋白表达，以荧光定量PCR(qPCR)法测定LacZ基因拷贝数。结果表明，新发现的SusMAR序列能增加β-gal蛋白在HEK293T细胞中的表达水平，并且不增加LacZ基因的拷贝数。本试验为治疗性蛋白稳定和高水平的表达奠定了基础。 2.CRISPR/Cas9系统快速简便构建串联sgRNA重组载体方法的建立及功能验证 为了优化AAV介导的CRISPR/Cas9基因编辑，提高其基因编辑的能力，本试验进行了以下工作: (1)本试验以片段较小的tRNA代替U6启动子，构建sgRNA-SPCas9分体式系统，并以pX601载体为骨架，构建重组pX601(tRNA)病毒载体，插入相关基因sgRNA，转染细胞后，通过T7EI法及TA克隆测序检测内源基因和外源基因编辑效果，并以qPCR法检测sgRNA相对表达量，以确定tRNA或U6启动子转录效率。 (2)同时，以较小的EF1α代替CMV启动子，构建重组pX601(EF1α-tRNA)病毒载体，通过T7EI法及TA克隆测序检测基因编辑效果，并以qPCR法检测SaCas9相对表达量。并将其包装成AAV-DJ病毒，检测病毒滴度，并转导NIH3T3细胞以检测基因编辑效率。 (3)更进一步的，以重组载体pX601（EF1α-tRNA)为骨架，以较为简便的两步克隆法构建含有不同长度spacer的串联sgRNA载体，并包装成AAV-DJ病毒，转导NIH3T3细胞，通过T7EI法检测基因编辑效果。 结果表明: (1)在针对外源基因EGFP进行编辑的试验中发现，tRNA组同样检测到了EGFP基因的编辑现象。同时，在靶向内源基因编辑的试验中，发现tRNA组同样检测到了针对内源基因的编辑现象;以qPCR法检测sgRNA转录情况，发现tRNA组的sgRNA相对表达量普遍低于U6组。但是通过TA克隆测序检测基因编辑效果，发现tRNA组显示出了比U6组更高的突变效率（约是其2.5倍）。 (2)较小的EF1α代替CMV启动子，发现同样具有基因编辑的效果，证明EF1α可以作为Cas9的启动子;但是发现EF1α组SaCas9mRNA表达量显著低于CMV组;TA克隆测序检测结果表明，EF1α与tRNA的组合获得的基因突变效率高于CMV与U6的组合2倍。将重组载体进行AAV-DJ型病毒包装，检测病毒滴度发现，AAV基因组较大的pX601-EGFP-mPcsk9-sg2重组载体（约5.6kb）也包装成了病毒，且与pX601(EF1α-tRNA)-EGFP-mPcsk9-sg2滴度(＜5kb)相近。但是，前者EGFP阳性细胞量显著低于后者(P＜0.05)。并且，其对Pcsk9基因的编辑效率低于后者。 (3)本试验以两步法成功构建含有不同长度spacer(0、10、20、40bp)的串联sgRNA重组载体，并检测到串联的sgRNA载体均能同时对多个基因进行编辑。将其包装AAV-DJ型病毒，结果发现4种重组载体均成功包装成了病毒，感染NIH3T3细胞后发现其基因编辑结果同质粒转染的结果一致，证明tRNA串联sgRNA可以被包装成病毒，并产生同时多个基因位点编辑的作用，但是其基因编辑效率受spacer长度的影响。 以上结果证实，CRISPR/Cas9系统中，tRNA可替代U6作为启动sgRNA转录的启动子，EF1α可代替CMV作为Cas9的启动子，在大幅缩短AAV病毒的基因组长度的同时，显著提高了Cas9系统的基因编辑效率;更进一步的，使用两步法，能更迅速有效的构建多sgRNA串联载体，使一个AAV病毒可以同时编辑多个基因位点，大幅缩短了工作时间并在很大程度上节约了试验成本。为AAV-Cas9组合应用于临床基因治疗奠定了一定的理论基础。
猪;转基因载体;基因编辑;MAR序列;PiggyBac系统
河南农业大学
博士
兽医学
杨国宇
2018
中文
S813.3;S828
2023-07-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）