AHR调控m6A RNA甲基化参与PM2.5心脏发育毒性
研究背景: 流行病学以及动物实验研究表明母体PM2.5暴露与胎儿心脏发育异常密切相关。我们前期研究发现PM2.5激活芳香烃受体(arylhydrocarbonreceptor，AHR)后引起斑马鱼胚胎心脏畸形，而甲基供体叶酸有拮抗作用，提示甲基化修饰参与PM2.5对心脏发育的影响。除DNA甲基化和组蛋白甲基化外，RNA上也存在甲基化修饰，但直到最近其作用机制才逐渐被揭示。m6ARNA甲基化是RNA中最常见的一种表观遗传修饰，但是m6ARNA甲基化在PM2.5心脏发育毒性中的作用尚不清楚。本文旨在研究斑马鱼胚胎中PM2.5如何影响m6ARNA甲基化以及m6A修饰异常干扰心脏发育的作用机制。 研究方法: 用5mg/LPM2.5可提取有机物(ex仃actableorganicmatter，EoM)在斑马鱼胚胎受精后2小时(2hpf)进行染毒，并添加5μM甲基供体甜菜碱或0.5μMAHR抑制剂CH223191(CH)。对斑马鱼受精卵注射0.5mM的ahr2吗啉寡核苷酸(MO)或体外转录的METTL14mRNA进行AHR基因敲减或METTL14过表达。受精后72小时(72hpf)在体式显微镜下观察各组胚胎发育状况，并统计存活率和心脏畸形率。使用二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)、MitoSoxTM红色线粒体超氧化物指示剂、MitonackerTMRedCMXRos以及吖啶橙进行染色，检测斑马鱼胚胎心脏部位的RoS水平、线粒体RoS水平、线粒体膜电位以及细胞凋亡水平。剖取72hpf斑马鱼胚胎心脏，以免疫荧光方法进一步检测m6ARNA甲基化水平、METTLl4表达以及cleavedcaspase-3。各组心脏组织提取总RNA后，进行MeRIP测序分析EoM引起的全基因组范围甲基化差异，通过qPCR检测mRNA表达水平。采用体内双荧光素酶报告基因验证AHR对METTL14基因的直接转录调控。 研究结果: (1)斑马鱼胚胎心脏中EoM引起m6ARNA整体甲基化水平降低，并且补充甲基供体甜菜碱后恢复至对照水平。甜菜碱可以拮抗EOM引起的线粒体损伤、氧化应激和细胞凋亡，并降低EOM引起的心脏畸形。 (2)AHR抑制剂CH拮抗EoM引起的斑马鱼胚胎心脏中m6ARNA整体甲基化水平降低。EoM还抑制甲基转移酶METTL14的mRNA及蛋白表达降低，AHR抑制剂CH或基因敲减有拮抗作用。体内双荧光素酶报告基因实验证实AHR直接抑制METTL14的转录。 (3)过表达METTL14明显减弱EOM引起斑马鱼胚胎心脏中细胞总体ROS以及线粒体ROS水平升高。AO染色以及cleavedcaspase-3免疫荧光结果显示过表达METTL14拮抗EoM引起的细胞凋亡。 (4)斑马鱼胚胎心脏中EOM引起全基因组范围的m6ARNA甲基化剧烈改变，并且部分甲基化位点的改变可被AHR抑制剂CH减轻，所涉及基因富集在Wnt、MAPK、钙信号传导等发育和凋亡相关信号通路。我们进一步发现EoM引起的氧化应激相关基因traf4a和凋亡相关基因bbc3以表达升高，这与其m6ARNA甲基化水平负相关。更重要的是，METTL14过表达能拮抗EOM引起的这两个基因的表达升高。 结论: 斑马鱼胚胎心脏中AHR被PM2.5激活后直接抑制甲基转移酶METTL14的转录，阻碍其表达，进而通过降低traf4a及bbc3的m6ARNA甲基化增加其表达，这可能导致了氧化应激和细胞凋亡，导致心脏畸形。
AHR调控;m6ARNA甲基化;PM2.5心脏发育毒性;细胞凋亡
苏州大学
硕士
卫生毒理学
陈涛
2022
中文
R-332
2023-01-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）